Виньяля — Вейона метод

Приборы, методы и среды для культивирования анаэробов

Виньяля — Вейона метод

Микроанаэростат – используется для создания вакуума с дозированным содержанием кислорода. Прибор представляет собой герметически закрывающийся сосуд, снабжённый манометром, в который помещают посевы и откачивают воздух. Микроанаэростат помещают в термостат.

Эксикатор– стеклянный лабораторный сосуд с притёртой крышкой. В его донной части имеется дополнительная емкость, куда наливается смесь пирогаллола и едкого натра или гидросульфита натрия и двууглекислой соды. На сетку-подставку помещают посевы и притирают крышку с помощью вазелина. Эксикатор помещают в термостат.

Метод Фортнера. В чашку Петри наливают питательный агар с
1-2% глюкозы. Посредине чашки стерильным скальпелем вырезают канавку шириной приблизительно 1 см.

Одну половину чашки засевают культурой аэробов (сарцина, кишечная палочка), вторую – культурой анаэробов или исследуемым на их наличие материалом. Засеянную чашку закрывают, герметизируют и помещают вверх дном в термостат.

Быстрорастущие аэробы, поглощая кислород, создают тем самым благоприятные условия для роста анаэробных микроорганизмов.

Метод Перетца. В стерильную чашку Петри помещают стеклянные палочки, на которые кладут стеклянные пластинки или предметные стекла.

В пробирку с 20 мл расплавленного и охлажденного до 500С МПА с 10% глюкозы (pH 7,0-7,2) вносят исследуемый материал и добавляют 2-4 капли 10% гидросульфита натрия на 10% растворе углекислой соды.

Содержимое пробирки быстро перемешивают и выливают в чашку с таким расчётом, чтобы агар заполнил пространство между стеклянной пластинкой и дном чашки. Чашки инкубируют при 370С 24-48 часов. Колонии анаэробов вырастают под стеклянной пластинкой.

Метод Вейон-Виньяля. В пробирку с 0,5% расплавленным и охлажденным до 40-450С сахарным агаром вносят исследуемый материал и перемешивают. При необходимости материал разводят путём переноса в последующие 2-3 пробирки с расплавленным агаром. Содержимое пробирок набирают в пастеровские пипетки.

После заполнения пипетки вытянутый конец запаивают, а противоположный конец закрывают стерильной ваткой и заливают парафином. Трубки помещают в термостат; через 2-3 суток в агаре вырастают глубинные колонии, видимые в проходящем свете, которые можно изолировать.

Для этого трубку надрезают напильником выше уровня намеченной колонии, надламывают, а колонию извлекают петлёй и пересевают для накопления чистой культуры в соответствующую питательную среду.

Метод Биттнера. К крышке чашки Петри с посевом исследуемого материала или выделенной культуры анаэробов прикрепляют пакет из фильтровальной бумаги, содержащей пирогаллол, К2СО3 и тальк.

Чашку герметизируют при помощи парафина или скотча. Содержимое пакета увлажняется за счёт образующегося конденсата, и ингредиенты вступают в реакцию, которая сопровождается поглощением О2 и выделением СО2.

Газ-пак (Generbaganaer). Система Generbaganaer состоит из воздухонепроницаемых пакетов, изготовленных из прозрачной пластмассы и генераторов, содержащих смесь веществ, поглощающих кислород.

Последовательность работы: вынуть генератор из пакета, поместить в нижнюю часть воздухонепроницаемого пакета, затем поместить чашки (или пробирки) с посевами и с помощью специальной скрепки закрыть пакет.

Инкубация при 370С.

Среда Китта-Тароцци. Содержит мясо-пептонный бульон, 0,5% глюкозы и 0,15% агара.

На дно пробирки для адсорбции О2 помещают кусочки варёной печени или фарша слоем 1-1,5 см и заливают 6-7 мл среды. Среду перед посевом регенерируют (прогревают 15-20 мин.

на водяной бане для удаления воздуха, а затем быстро охлаждают). После посева среду заливают вазелиновым маслом и помещают в термостат.

Полужидкий сахарный агар (высокий столбик). В пробирку с
6-7 мл расплавленного и охлаждённого до 40-450С полужидкого питательного агара, содержащего 0,5-1% глюкозы, вносят исследуемый материал и перемешивают. Посевы помещают в термостат.

Среда для контроля стерильности (СКС). Рост многих анаэробных микроорганизмов возможен только на средах с низким окислительно-восстановительным потенциалом.

Поэтому в среды добавляют восстановители, например, тиогликолевую кислоту или её натриевую соль, цистеин, аскорбиновую кислоту. Функции восстановителей выполняют и другие компоненты среды: глюкоза, пептон.

СКС содержит питательный бульон, витаминный препарат ЭКД, NaCl, Na2CO3, глюкозу, тиогликолят натрия, цистеин, агар (0,75%). Среду разливают в пробирки по 6-7 мл.

Выделение чистой культуры бактерий – аэробов из материала, содержащего смесь микробов, занимаеткак правило 3 дня и производится по следующей схеме:

1 день – микроскопия мазка из исследуемого материала, окрашенного по Граму – для предварительного ознакомления с микрофлорой данной смеси. Посев материала петлёй на чашку Петри с питательной средой штриховым методом для получения изолированных колоний. Засеянные чашки помещают в термостат на сутки.

2 день – изучение колоний, выросших на чашках, отбор изолированных колоний, описание их и микроскопия мазков из изолированных колоний (окраска по Граму) для проверки однородности микробов в колонии. Пересев изолированной колонии на скошенный агар для получения чистой культуры. Посевы помещают в термостат на сутки.

3 день – проверка чистоты культуры, выросшей на скошенном агаре, путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму. При однородности исследуемых бактерий выделение чистой культуры можно считать законченным.

Контрольные вопросы.

Химический состав бактериальной клетки: содержание, локализация в клеточных структурах и биологическая роль воды, белков, нуклеиновых кислот, липоидов, углеводов, минеральных веществ. Что такое энергетический и конструктивный метаболизм (катаболизм ианаболизм)? Особенности обмена веществ бактерий.

Механизм расщепления бактериями питательных веществ. Способы поступления их в клетку. Типы питания микробов.

Могут ли микроорганизмы изменить тип питания? Какие типы питания имеются у патогенных микробов? Питательные среды – для чего применяются, каким требованиям они должны соответствовать? Классификация питательных сред по составу, по консистенции, по назначению. Обычные (простые) питательные среды.

Специальные питательные среды, для чего применяются, принцип их действия. Дифференциально-диагностические среды, принципы их действия, для чего применяются, примеры. Что такое рост микроба? Что такое размножение микроба? Как размножаются бактерии? Фазы роста бактериальной культуры.

Размножение бактерий в непрерывно-проточной среде. Культивирование бактерий. Что такое культура бактерий, чистая культура, штамм, клон?Что такое колония микробов? Методы выделения чистой культуры бактерий. Рассказать поэтапно (по дням) выделение чистой культуры бактерий аэробов. Рассказать поэтапно выделение чистой культуры анаэробов.

Источник: //megaobuchalka.ru/8/2278.html

Микробиология, вирусология, иммунология: Методические указания для самостоятельной работы и к практическим занятиям для студентов лечебного, педиатрического и стоматологического факультетов. Часть I, страница 13

Виньяля — Вейона метод

          Посев поФортнеру. Кровяной питательный агар разливают в чашки Петри толстым слоем,после застывания по диаметру агар вырезают в виде узкой щели.

На одну половинучашки засевают культуру аэробного микроба, жадно поглощающего кислород(кишечную палочку, чудесную палочку), а на другую половину засевают исследуемыйматериал. Чашку закрывают, заливают парафином.

Аэробные бактерии быстроиспользуют кислород воздуха в герметически закрытой чашке, затем начинаютразмножаться анаэробы, через 24-48 часов чашку открывают и из отдельных колонийанаэробов выделяют чистую культуру.

          Посев поВейон-Виньялю в пастеровских пипетках. Пастеровские пипетки представляютсобой длинные трубки (20-25 см) диаметром около 5 мм, приготовленные из легкоплавкого стекла. Один конец пипетки открыт, а другой вытянут в видекапилляра и запаян. Перед стерилизацией в широкий конец вставляют вату.

Исследуемый материал разводят полужидким агаром с небольшим содержание глюкозы,затем из каждого разведения насасывают агар в стерильную пастеровскую пипетку,предварительно обломив запаянный конец капилляра, и избегая попадания пузырьковвоздуха. Затем капилляр запаивают и пипетки помещают в термостат.

Через 24-48часов в среде можно обнаружить ясно видимые колонии бактерий в виде пушинок,комочков ваты, зерен чечевицы и т.д. Нужные колонии можно извлечь, распиливтрубку.

Выделение чистыхкультур анаэробных бактерий

1 этап. Накоплениематериала.

          Исследуемыйматериал, предварительно прогретый в течение 15 мин при 80°С для уничтожениявегетативной флоры (споры анаэробов при этом не гибнут), засевают на средуКита-Тароцци и ставят в термостат.

2 этап. Выделениечистой культуры.

          Послесуточного инкубирования в результате роста микробов среда мутнеет, иногда в нейвидны пузырьки газа. Выделение культуры проводят или по методу Цейсслера или пометоду Вейнберга.

Метод Цейсслера. Каплю материала сосреды Китта-Троцц помещают в чашку с кровяным сахарным агаром, тщательно распределяютего по поверхности среды шпателем, затем этим же шпателем делают посев вовторой и третьей чашке.

Сутки инкубируют чашки в термостате в анаэробныхусловиях.

На следующий день по форме колоний и морфологии микробов, изученной вмазках, окрашенных по Граму, ориентировочно определяют вид бактерий, изученныеколонии пересевают на среду Кита-Тароцци для выделения чистой культуры иточного определения виды микроорганизмов.

Метод Вейнберга. 1-2 капли материаласо среды Кита-Тароцци вносят в пробирку с МПБ для разведения.

Затемпастеровской пипеткой с запаянным концом переносят материал последовательно в3-5 узких пробирок с сахарным МПА, предварительно расплавленным и прокипяченнымв течение 20 мин и остуженным до 50°С, погружая капилляр пипетки врасплавленный агар до дна пробирки.

Засеянные пробирки быстро охлаждают подструей холодной воды, при этом агар застынет и зафиксирует разобщенноеположение отдельных микробных клеток. Инкубируют в анаэробных условиях. Черезсутки отбирают колонии, на уровне колонии пробирку распиливают, колониюотсасывают пипеткой и переносят в среду Китта-Троцци для накопления иидентификации.  

ЗАНЯТИЕ 10

ТЕМА: СТЕРИЛИЗАЦИЯ

План занятия

1.  Понятие«стерилизация»

2.  Методы и способыпроведения стерилизации

3.  Режим работы иустройство парового стерилизатора

4.  Стерилизация текучимпаром

Цель занятия: Ознакомить студентов с методамистерилизации, научить пользоваться этими методами

Методические указания к демонстрации

          Стерилизация– это комплекс мероприятий, направленных на полное уничтожение вегетативныхформ микробов и их спор в объектах внешней среды. Стерилизации подвергаютинструменты, аппараты, лекарственные препараты, перевязочный материал и белье,питательные среды, растворы, лабораторную посуду. Стерилизацию проводятфизическими и химическими методами, а также механическим путем.

          Физическиеметоды стерилизации основаны на действии ультрафиолетовых лучей, применениивысокой температуры.  Летальное действие высокой температуры обусловленоденатурацией белков, деградацией нуклеиновых кислот, липидов, мембран.Существуют различные способы стерилизации при помощи высокой температуры.

          Прокаливаниев пламени спиртовки – самый быстрый и достаточно надежный метод стерилизации.Метод имеет ограниченное применение, т.к. при его использовании портятсястерилизуемые предметы. Прокаливанием стерилизуют бактериальные петли и иглы,мелкий инструментарий.

          Кипячение –это простой метод, но он не обеспечивает полного обеспложивания, т.к. спорыбактерий не погибают. Стерилизуют кипячением в воде с добавлением 1%бикарбоната натрия в течение 45 мин иглы, шприцы, инструменты.

          Стерилизациясухим жаром – проводится в особых аппаратах-печах Пастера или сухожаровыхпечах. Метод основан на бактерицидном действии нагретого до 165-180°С воздуха.Стерилизуют сухим жаром только сухие предметы, размещая их так, чтобы они некасались стенок шкафа и между ними свободно проникал нагретый воздух.

Сухимжаром стерилизуют всю стеклянную посуду, градуированные и пастеровские пипетки,вату, марлю, обернутые в бумагу в течение 1 часа при 160-170°С.

Применениетемпературы выше 170°С приводит в выгонке жирных и смолистых веществ из ваты инекоторых сортов оберточной бумаги, что может вызвать подавление ростамикробов, поэтому при использовании температуры выше 170°С посуду стерилизуют вметаллических пеналах.

          Стерилизацияпаром не требует такой высокой температуры, как стерилизация сухим жаром, т.к.пар из-за большой теплопроводности  действует на микробы эффективнее.Обеспложивание паром проводится при температуре 100-120°С. Существуют дваспособа стерилизации паром:

Источник: //vunivere.ru/work15345/page13

Методы культивирования и выделения чистых культур анаэробных микроорганизмов

Виньяля — Вейона метод

Для культивирования анаэробов необходимо создать с помощью физических, химических и биологических методов условия анаэробиоза – пониженного содержания кислорода в среде и окружающем ее пространстве.

Физические методы:

· механическое удаление воздуха из сосудов, в которых выращиваются анаэробные микроорганизмы – анаэростатов (рис. 26, см. приложение), с помощью разрежающих насосов.

Анаэростат представляет собой цилиндр из ударопрочного полимерного материала или металла с хорошо притертой крышкой, снабженный отводящим краном и вакуумметром.

После размещения засеянных чашек или пробирок воздух из анаэростата удаляют с помощью вакуумного насоса;

· посев в среды, содержащие редуцирующие и легко окисляемые вещества, которые связывают растворенный в среде кислород. С целью уменьшения содержания кислорода в питательной среде, ее перед посевом кипятят 10—15 мин, затем быстро охлаждают, после чего заливают небольшим количеством стерильного вазелинового масла.

Легко окисляемыми веществами являются глюкоза, лактоза и др.

Лучшей жидкой питательной средой с редуцирующими веществами является среда Китта — Тароцци, которая с успехом используется для накопления анаэробов при первичном посеве из исследуемого материала и для поддержания роста выделенной чистой культуры анаэробов;

· посев микроорганизмов в глубину плотных пи­тательных сред про­изводят по способу Виньяль — Вейона, который состоит в механической защите посевов анаэробов от кислорода воздуха. Для этого берут стеклянную трубку длиной 30 см и диаметром 3—6 мм.

Один конец трубки вытягивают в капилляр в виде пастеровской пипетки, а у другого конца делают перетяжку. В оставшийся широкий конец трубки вставляют ватную пробку. В пробирки с расплавленным и охлажденным до 500 С питательным агаром засевают исследуемый материал.

Затем насасывают засеянный агар в стерильные трубки Виньяль — Вейона. Капиллярный конец трубки запаивают в пламени горелки и трубки помещают в термостат.

Для выделения отдельной колонии трубку надрезают напильником, соблюдая правила асептики, на уровне колонии ломают, а колонию захватывают стерильной петлей и переносят в пробирку с питательной средой для дальнейшего выращивания и изучения в чистом виде;

· замена воздуха в анаэростатах или эксикаторах индифферентным газом (азотом, водородом, аргоном, углекислым газом) путем вытеснения его газом из баллона.

Химические методы основаны на поглощении кислорода воздуха в анаэростате или эксикаторе такими веществами, как пирогаллол или гидросульфит натрия;

Биологические методы основаны на совместном выращивании анаэробов со строгими аэробами. На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую – анаэробов. Края чашки заклеивают пластилином или заливают расплавленным парафином, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом (через 3-4 дня) – анаэробы.

Комбинированные методы основаны на сочетании физических, химических и биологических методов создания анаэробиоза.

САМОСТОЯТЕЛЬНАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ

1. Выделение чистой культуры аэробных бактерий от потенциального носителя золотистого стафилококка (самостоятельная работа). Продолжить работу по бактериологическому исследованию, начатую на предыдущем занятии: рассмотреть чашку с выросшими колониями и обвести карандашом по дну различные типы колоний, у которых изучить культу­ральные свойства в соответствии с таблицей 3.

Учитываются следующие признаки колоний:

· размер (измеряется миллиметровой полоской со стороны дна диаметр колонии);

· форма (круглая, неправильная);

· цвет (красный, желтый и т.д.). Беспигментные колонии имеют отте­нок среды, например сероватый на МПА;

· поверхность (выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, шероховатая);

· край (ровный, изрезанный, волнообразный, фестончатый). Колонии зарисовать.

Таблица 3. Характеристика колоний бактерий

Признаки колоний Описание свойств колоний
Размер Проводится измерение диаметра колоний
Форма Круглая, неправильная
Цвет Красный, желтый и т.д. Беспигментные колонии имеют оттенок среды, например, сероватый на МПА
Поверхность Выпуклая, плоская, блестящая, матовая, гладкая, морщинистая, шероховатая, исчерченная и т.д.
Структура Чашка Петри с ростом колоний кладется дном вверх на предметный столик микроскопа и колония изучается у ее края при малом увеличении с опущенным конденсором. Структура может быть гомогенной, мелко-, крупно-, неравномерно-зернистой, волокнистой
Край Изучается вместе со структурой. Может быть ровным, изрезанным, волнообразным, фестончатым
Консистенция Определяется при взятии петлей для приготовления мазка. Консистенция может быть слизистой (культура тянется – подозрение на наличие капсулы), влажная (легко берется) и сухая (крошится – подозрение на спорообразующие бактерии)
Тинкториальные (отношение к окраске) и морфологические свойства Изучаются соответствующие свойства бактерий, находящихся в колонии

Для дальнейшего изучения выбирают одну из колоний. С целью сохранения и накопления выделенной чистой культуры сделать пересев из колонии на скошенный МПА.

Техника пересева: снять крышку чашки, взять чашку в левую руку в вертикальном положении, посевом обратив к себе.

Стерильной петлей взять из центра колонии культуру и засеять на скошенный МПА зигзагообразной линией, двигаясь снизу вверх.

Прокалить петлю в пламени спиртовки, аккуратно подписать пробирку в верхней трети и поместить ее в термостат на сутки. Результаты исследования занести в протокол. Работа будет продолжена на следующем занятии.

6. Изучение методов культивирования анаэробов и ознакомление с аппаратурой, используемой с этой целью (демонстрация).

Культивирование анаэробов проводят в бескислородных условиях, для чего с целью удаления кислорода к питательным средам добавляют кусочки печени, а также редуцирующие вещества (сульфат железа, глюкоза и др.).

Наиболее широко в бактериологической практике применяются следующие методы культивирования анаэробов:

· Метод Вейнберга (на сахарном МПА столбиком). В расплавленный МПА в пробирке бактериологической иглой или петлей добавляют исследуемый материал, тщательно перемешивают содержимое пробирки, охлаждают. В нижней части пробирки создаются оптимальные условия для роста анаэробов,

· Метод Вейон-Виньяля. Готовят разведения исследуемого материала в нескольких пробирках с МПА, затем содержимое каждой пробирки набирают в специальную стеклянную трубку, один конец которой вытянут в виде капилляра (как у пастеровской пипетки), а другой конец имеет сужение.

После заполнения трубки капилляр запаивают в пламени спиртовки, а суженную часть трубки закрывают кусочком ваты. Трубку охлаждают, помещают в термостат. Через 2-3 дня в столбике МПА вырастают колонии анаэробов.

Напильником делают надрез выше уровня намеченной колонии, трубку надламывают, колонию извлекают из агара петлей и пересевают на среду Китт-Тароцци.

· Выращивание в анаэростатах – в металлических или пластмассовых сосудах с герметически закрывающейся крышкой, воздух из которых отсасывается с помощью разрежающего насоса или заменяется газовым составом.

· Создание анаэробных условий в эксикаторах (герметически закрывающиеся стеклянные сосуды) с использованием химических поглотителей кислорода или заменой кислорода инертным газом.

· Биологический метод культивирования анаэробов (по Фортнеру). На одну половину чашки Петри с МПА засевают культуру аэробов, на другую – анаэробов. Бортики чашки оклеивают лейко­пластырем, посев ставят в термостат. Сначала вырастают аэробы, потом анаэробы.

2. Выделение чистой культуры анаэробных бактерий из почвы (демонстрация):

· изучение характера роста на среде Китт-Тароцци;

· изучение морфологических и тинкториальных свойств микроор­ганизмов, выросших на среде Китт-Тароцци; приготовление мазка, окраска его по Граму, микроскопия.

Обратить внимание на наличие в микропрепарате крупных, расположенных беспорядочно или короткими цепочками, грамположительных палочек; выполнить посев одной петли материала со среды Китт-Тароцци в высокий столбик МПА, расплавленного на водяной бане и остуженного до 45° С. Результаты исследования занести в протокол.

3. Выделение чистой культуры протея по методу Шукевича (самостоятель­ная работа). Произвести посев исследуемого материала петлей в конденсацион­ную воду скошенного МПА. Ход исследования отразить в протоколе.



Источник: //infopedia.su/9x13059.html

Методы культивирования и выделения чистой культуры анаэробов

Виньяля — Вейона метод

Необходимымусловием при культивировании анаэробовявляется защита их от токсическоговоздействия молекулярного кислорода.Это достигается при по­мощи физических,химических и биологических методов.

Физическиеметоды:

1. Регенерациясред. Дляудаления растворенного в питательныхсредах кислорода производят их кипячениев течение 15-20 минут на водяной бане споследующим быстрым охлаждением до45-50°С. После посева культуры дляпредот­вращения проникновениякислорода в жидкую питательную средуее поверхность заливают стерильнымвазелиновым маслом или парафином.

2. Посев в “высокийстолбик агара”.Питательную среду разливают в пробиркипо 10 мл и прогревают на кипящей водянойбане для удаления кислорода, после чегоохлаждают до температуры 45°С и вносятисследуемый материал.

Пробирки с посевамипомещают в обычный термостат.

В высокомстолбике плотной или полужидкойпитательной среды кислород воздухадиффундирует обычно на расстояние1,5-2,0 см от поверхности, а в глубинеостаются благоприятные условия дляроста облигатных анаэробов.

3.Эвакуационно-заместительный методзаключается в механическом удалениивоздуха из гер­метически закрытогососуда, который называется анаэростат,при помощи ва­куумного насоса споследующей заменой его инертным газомили бескислородной газовой смесью.

Химическиеметоды:

1. Применениещелочных растворов пирогаллоладля поглощения кислорода в замкнутойвоздушной среде

2. Применениегидросульфита натриядля поглощения кислорода из замкнутогопространства.

3. Использованиередуцирующих веществ.Для связывания остатков кислорода впитательных средах используютвещества-редуценты, к которым относятсятиогликолевая кислота, аскорбиноваякислота, различные сахара, цистин ицистеин.

4. Применениегазогенерирующих системдля создания анаэробных условий взамкнутой воздушной среде (микроанаэростатах,эксикаторах, прозрачных газонепроницаемыхпластиковых пакетах).

Для образованияводорода и двуоки­си углерода используютспециаль­ные таблетки, которыеактивируются добавлением воды. Водородгенерируется таблетками боргидриданатрия.

Углекислый газ вырабатываетсяпри взаимодействии лимонной кислоты сбикарбонатом натрия.

Биологическийметод

Совместноевыращивание анаэробов и аэробов (методФортнера).На одну половину чашки Петри с плотнойпитательной средой засевают исследуемыйматериал, а на другую – лабораторнуюкультуру известных аэробных бактерий.После посева чашку герметично закрываюткрышкой. Вначале вырастают аэробы,поглощающие кислород, а затем – анаэробы.

Методы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Для полученияизолированных колоний облигатныханаэробов используют следующие методы:

Метод Цейсслера.Исследуемый материал рассевают штрихамипо поверхности плотной питательнойсреды, помещают в анаэростат и выдерживаютв термостате при 37°С в течение 24-72 часов.

Метод Вейнберга.

Несколько капель исследуемого материалавносят в пробирку с 4-5 мл изотоническогораствора хлористого натрия, перемешиваютзапаянным капилляром и переносят впробирку с расплавленным и охлажденнымдо 45-50°С сахарным агаром, разлитымвысоким столбиком. После перемешиванияэтим же капилляром последовательнозасевают еще две пробирки с сахарнымагаром и быстро охлаждают. Пробиркиинкубируют в обычном термостате.

Метод Виньяля-Вейона.В пробирку с 0,5% расплавленным иохлаж­денным до температуры 40-45°Ссахарным агаром вносят пипеткой небольшоеколичество исследуемого материала итщательно размешивают.

Затем содержимымпробирки заполняют капилляры трехпастеровских пипеток. После заполнениявытянутый конец трубки запаивают ипомещают в стеклянный цилиндр с ватойна дне.

Через 2-3 суток в столбике агаравырастают ясно видимые колониимикробов-анаэробов.

Метод Перетца.Готовят разведения исследуемогоматериала в 0,5% расплавленном агаре.Содержимое пробирки выливают в стерильнуючашку Петри, на дне которой на двухстеклянных или деревянных палочкахрасполагается стеклянная пластинкаразмером 6×6 см. Среду заливают сбокутаким образом, чтобы она заполнилапространство между пластинкой и дномчашки Петри.

Наиболее простойи удобной разновидностью метода Перетцаявляется метод“перевернутых чашек”.

При этом каждое разведение исследуемогоматериала в пробирке с сахарным агаромзаливают в крышку чашки Петри и закрываютее стерильным донышком чашки, избегаяобразования пузырей воздуха.

Щель меж­дукраями крышки и дном чашки Петри заливаютрасплавленным парафином и термостатируютпри 37°С до появления изолированныхколоний анаэробов.

Выращиваниечистой культуры анаэробовпроизводят путем посева материала изизолированной колонии на средуКитта-Тароцци, в состав которой входитмясной бульон, глюкоза и кусочки печениили фарша. Для предотвращения доступакислорода среда покрыта слоем вазелиновогомасла.

Контрольныевопросы по теме занятия:

1. Ферменты бактерий.

2. Методы изученияферментативной активности микроорганизмов.

3. Дыхание бактерий.

4. Методыкультивирования и выделения чистойкультуры анаэробов.

Литература дляподготовки к занятию:

Основнаялитература:

1. Медицинскаямикробиология, вирусология и иммунология.Под ред. А.А. Воробьева. М., 2004.

Дополнительнаялитература:

1. Л.Б. Борисов.Медицинская микробиология, вирусология,иммунология. М., 2002.

2. О.К. Поздеев.Медицинская микробиология. М., ГЭОТАР-МЕДИА,2005.

3. Медицинскаямикробиология. Справочник. Под ред. В.И.Покровского и О.К. Поздеева. М., ГЭОТАР-МЕД,1998.

Источник: //studfile.net/preview/5244800/page:3/

Методы создания бескислородных условий для культивирования анаэробов

Виньяля — Вейона метод

Для создания бескислородных условий используются физические, химические и биологические методы.

Физические методы:

1) посев в глубину плотных питательных сред (кровяной или сахарный агар):

          а) посев уколом в высокий столбик агара (анаэробы вырастают в глубине посева);

          б) посев в трубках Виньяля-Вейона;

2) выращивание на специальных средах на среде Китта-Тароцци (жидкая питательная среда – 0,5 % глюкоза, кусочки животных тканей, например, печени, которая связывает кислород). Перед посевом среду кипятят и быстро охлаждают. После посева заливают слоем стерильного вазелинового масла.

в) выращивание в анаэростатах – специальный сосуд, из которого удален кислород.

Анаэростат – толстостенный металлический цилиндр с хорошо притертой крышкой с резиновой прокладкой. В него ставят чашки Петри (крышкой вверх) с посевами и удаляют воздух или вытесняют инертным газом.

Химические методы – поглощение кислорода воздуха в герметически закрытом сосуде (аппарате Аристовского) химическими веществами (такими как щелочной пирогаллол или гидросульфит натрия).

Биологические методы (метод Фортнера) – совместное выращивание анаэробов и аэробов. После посева чашки Петри герметически закрывают пластилином или парафином. Вначале в чашке Петри размножаются аэробы, а когда весь кислород используется, начинают расти анаэробы.

Выделение чистой культуры аэробных и анаэробных бактерий.

Чистая культура микроорганизмов – это популяция клеток (видимый рост) одного вида, выросшая на стерильной питательной среде.

Выделение чистой культурыбактериологический метод. Этот метод является основным методом диагностики бактериальных инфекций.

Для получения чистой культуры необходимо отделить бактериальные клетки разных видов друг от друга. Чаще всего используются механические способы отделения клеток– специальные методы посева:

а) посев шпателем по Дригальскому в три чашки Петри; на третьей чашке вырастают отдельные колонии; каждая колония – один вид, т.к. колония – потомство одной клетки;

б) посев петлей “штрихами” или “сеткой”: делают посев прерывистыми штрихами; в том месте, где на агар попало большое количество микробных клеток, рост будет в виде сплошного штриха, а на штрихах с небольшим количеством клеток вырастут отдельные колонии;

Таким образом, при помощи специальных методов посева получают изолированные колонии разных видов бактерий.

Выделение чистой культуры проводят в три этапа:

Первый этап (1-ый день):

а) из материала (смесь бактерий разных видов) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют;

б) делают посев материала (смеси бактерий) на чашку Петри с МПА штриховым методом или по методу Дригальского и ставят в термостат при 37°С на 24-48 часов.

Второй этап (2-ой день):

а) наблюдают посевы и проводят описание колоний разных видов (размер, форма, цвет, поверхность, форма края, структура, консистенция);

б) из колоний готовят мазки и окрашивают по Граму (колония должна содержать один вид бактерий);

в) делают пересев разных колоний в разные пробирки со скошенным МПА для накопления чистой культуры; выращивают в термостате при 37°С 24 часа.

Третий этап (3-ий день): проделывают работу по идентификации (определение вида) культуры и проверяют чистоту культуры. Для определения вида изучают морфологические, культуральные, тинкториальные и биохимические свойства:

а) отмечают характер роста выделенной чистой культуры на МПА (визуально она характеризуется однородным ростом);

б) готовят мазок, окрашивают по Граму и микроскопируют; если культура чистая, то обнаруживают одинаковые морфологические и тинкториальные клетки;

в) делают посев на среды Гисса и МПБ для изучения сахаролитических и протеолитических свойств чистой культуры; оставляют в термостате при 37° С на 24 часа.

По совокупности морфологических, тинкториальных, культуральных и биохимических свойств делают вывод о видовой принадлежности выделенной чистой культуры бактерий. При необходимости изучают и другие признаки (факторы вирулентности, антигенную структуру, чувствительность к фагам и др.).

В бактериологической практике установление вида возбудителя позволяет поставить диагноз заболевания, поэтому выделение и идентификация чистой культуры – это и естьбактериологический метод диагностики инфекционных заболеваний. Постановка этого метода обязательно включает и определение чувствительности выделенной чистой культуры возбудителя к антибиотикам (определение антибиотикограммы).

Выделение чистой культуры анаэробных бактерий также осуществляется в три этапа. При этом также получают чистую культуру из одной клетки и добиваются роста микроорганизмов в виде изолированных колоний с последующим ее пересевом и идентификацией.

Особенностью работы по выделению чистой культуры анаэробов является применение различных методов создания бескислородных условий (см. выше).

Три этапа:

Первый день. Делают посев (земля, гной) на среду Китта-Тароцци.

Второй день: для получения колоний делают пересев со среды Китта-Тароцци по методу Цейсслера, методу Вейнберга и методу Перетца.

Третий день: колонии пересевают в пробирку с новой средой Китта-Тароцци для накопления чистой культуры; проводят идентификацию чистой культуры анаэробов по морфологическим, культуральным, тинкториальным, биохимическим и антигенным свойствам.

Посев по методу Цейсслера. Каплю (петлю) материала со среды Китта-Тароцци последовательно засевают в три чашки Петри с кровяным агаром.

Посевы ставят в анаэростат или аппарат Аристовского, которые ставят в термостат. На следующий день на третьей чашке вырастают отдельные колонии.

Делают пересев этих колоний на среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры, изучения ее свойств и точного определения вида микроорганизмов.

Посев по методу Вейнберга. Пастеровской пипеткой переносят материал со среды Китта-Тароцци последовательно в 3-5 узких пробирок с сахарным МПА, погружая пипетку в расплавленный агар до самого дна пробирки.

Пробирки быстро охлаждают под холодной водой. Агар застывает и разобщает микробные клетки в глубине агара.

Из этих клеток вырастают колонии, которые пересевают в новую среду Китта-Тароцци, накапливают чистую культуру и идентифицируют.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: //studopedia.ru/3_68633_metodi-sozdaniya-beskislorodnih-usloviy-dlya-kultivirovanie-anaerobov.html

Ваш Недуг
Добавить комментарий