Стандарт мутности

При некоторых микробиологических исследованиях возни­кает необходимость посева определенного количества микроб­ных тел в жидкую или плотную питательную среду. В таких случаях из микробной культуры, предназначенной для посева, пользуясь бактериальным стандартом мутности, готовят взвесь, содержащую в единице объема (1 мл) заданное количество микробных тел.

Государственным научно-исследовательским институтом стандартизации и контроля медицинских и биологических пре­паратов им. Л.А.Тарасевича изготовлен отраслевой стандарт­ный образец мутности ОСО 42-28–85–02П[1] для визуального определения концентрации микробной взвеси.

Комплект ОСО 42-28-85–02 состоит из двух пробирок-эта­лонов, соответствующих 10 и 5 единицам мутности.

Эталон ОСО на 10 единиц мутности ориентировочно соот­ветствует следующим концентрациям клеток в 1 мл:

0,93х109 клеток/мл для микробов кишечной группы;

11х109 клеток/мл для микробов коклюшной группы;

1,7х109 клеток/мл для бруцеллезных микробов;

2,2х109 клеток/мл для холерного вибриона;

5х109 клеток/мл для туляремийных микробов.

Перед началом каждого измерения пробирку эталона ОСО, держа в руке в горизонтальной плоскости, нерезко встряхивают в течение 10–15 с с амплитудой 50–100 мм и частотой встря­хивания 1–2 раза в секунду. Затем исследуемую бактериальную взвесь наливают в объеме 6–7 мл в пробирку, входящую в комплект ОСО, что соответствует объему наполнения жидкос­тью ОСО.

Исследуемая бактериальная взвесь должна быть гомогенной с равномерным распределением частиц взвеси в пробирке.

Пробирку ОСО совмещают с исследуемой бактериальной взве­сью в вертикальном положении на уровне глаз, приложив плотно к задней поверхности шрифтовую таблицу.

Пробирки освещаются равномерно источником рассеянного света, кото­рым могут быть люминесцентная лампа мощностью от 20 до 40 Вт, лампа накаливания матовая (с плафоном) мощностью от 40 до 60 Вт, а также рассеянный дневной свет.

В случае одинаковой четкости видимых элементов шрифто­вой таблицы через ОСО и пробирку с исследуемой бактери­альной взвесью мутность их считают одинаковой, равной мут­ности, указанной на этикетке ОСО.

Если мутность исследуе­мой бактериальной взвеси не совпадает с пробиркой эталона ОСО, прибегают к уравниванию мутности, добавляя в зависи­мости от существующего различия физиологический раствор или микробную взвесь высокой концентрации[2].

8.3.1. Стандарт мутности по McFarland

Стандарт мутности по McFarland (МcF) также используется при приготовлении бактериальной суспензии определенной мут­ности. Методика его изготовления заключается в следующем:

  • • Изготавливаются растворы: ВаСl2 – 1 %,

Н2SO4 – 1 %.

ВНИМАНИЕ! ВаСl2 – ядовитое вещество; Н2SO4 – обжигающее вещество.

  • Для приготовления стандарта мутности и бактериальной взвеси, подлежащей исследованию, подбираются пробирки одного диаметра.
  • В пробирки изготавливаемого стандарта разливается Н2SO4 в объеме, указанном в табл. 8.2, и к ней добавляется раствор ВаСl2 для получения общего объема 10 см3.
  • Пробирки с изготовленным стандартом тщательно закрыва­ются завинчивающимися пробками и заливаются сургучом.

При изготовлении исследуемой бактериальной суспензии необходимо проследить, чтобы жидкость в стандарте МсF и исследуемой пробирке была гомогенно мутной.

Количественная характеристика исследуемой микробной взвеси определяется сравнением с ближайшими по мутности пробирками тем же способом, как при использовании ОСО 42-28-85-02.

Таблица 8.2. Количественная оценка бактериальных взвесей по шкале МсРаНапс!

Номер по шкале МсFОбъем, см3Приблизи­тельное количество, микроб/см3Соответствующая микробная взвесь, х108/мл
Н2SO4 1 %ВаСl2 1 %
0,59,950,051х1081,5
19,90,13х1083
29,80,26х1086
39,70,39х1089
49,60,412х10812
59,50,515х10815
69,40,618х10818
79,30,721х10821
89.20.824×10824
99,10,927х10827
109,01,030х10830

[1] Последние две цифры в номере ОСО означают год его выпуска.

[2] Стандартный образец мутности ГНИИСК МБП им. ЛАТарасевича внесен в реестр отраслевых стандартных образцов медицинских иммуно­логических препаратов, допущенных к применению в системе Минздрава РФ и на предприятиях других ведомств, выпускающих иммунологические препараты.

Источник: //petritest.ru/spravochnik-mikrobiologa/labinskaya-obshchaya-i-sanitarnaya-mikrobiologiya/8-3-bakterialnyj-standart-mutnosti-i-rabota-s-nim

Стандарт мутности

Стандарт мутности

При проведении различных бактериологических исследований часто возникает необходимость приготовить инокулюм, содержащий определенное количество микробных клеток (вернее сказать – колониеобразующих единиц, КОЕ). Для этого готовят серию последовательных разведений исходной суспензии. Концентрацию клеток в ней оценивают, сравнивая ее мутность с контрольным эталоном.

Первоначально эталон готовили из взвеси Salmonella typhi, инактивированных 2% формалином или прогреванием при 60 0С в течение 1,5 часов и законсервированных добавлением 0,5% фенола. Однако, бактериальные эталоны мутности очень нестабильны при хранении и им на смену пришел стеклянный международный эталон.

Стандарт мутности (син.: международный стандарт мутности, стеклянный стандарт мутности), утвержденный Всемирной организацией здравоохранения первичный эталон мутности для оптической стандартизации бактериальных взвесей, соответствующий мутности взвеси бактерий Борде — Жангу, содержащей 1010 клеток в 1 мл, т.е.

равный 10 единицам мутности; представляет собой взвесь частиц стекла пирекс. В нашей стране такой эталон выпускает Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля биологических препаратов имени Л. А. Тарасевича.

Он представляет собой взвешенные в дистиллированной воде частицы стекла «Пирекс» диаметром от 0,5 до 3,5 мкм. Взвесь этого стекла химически устойчива, не коагулирует при седиментации частиц, при взбалтывании осадка образует взвесь исходной дисперсности и мутности.

Стандарт состоит из трех запаянных пробирок-эталонов, эквивалентных по степени мутности 5, 10 и 20 международным единицам мутности. Мутность стандарта на 10 единиц соответствует следующей концентрации микроорганизмов:

микробы кишечной группы8,5 · 108 КОЕ/мл 
микробы коклюшной группы1,0 · 1010 КОЕ/мл
бруцеллы1,5 · 109 КОЕ/мл
холерный вибрион2,0 · 109 КОЕ/мл
туляремийные микробы4,5 · 109 КОЕ/мл

К комплекту бактериальных эталонов прилагаются шрифтовая таблица, содержащая набор различных шрифтов, и две пустые пробирки, диаметр, толщина стенок и цвет стекла которых точно соответствуют пробиркам-эталонам, так как при сравнении микробной взвеси одной концентрации, содержащейся в пробирках разных диаметров, мутность жидкости будет неодинаковой.

Хотя стеклянный стандарт официально является международным, наиболее широкое распространение в лабораторной практике получил стандарт McFarland на основе хлорида бария. Предложенный Джозефом Макфарландом в 1907 году, этот эталон указан практически во всех  нормативных документах, включая стандарты серий DIN, ISO, EN.

Шкала McFarland охватывает диапазон от 1,0 · 108 КОЕ/мл до 3,0 · 109 КОЕ/мл (0,5 – 10 Ед). Ведущие микробиологические фирмы производят стандарты, наиболее часто применяемые в лабораториях в повседневной работе, однако, при необходимости они легко могут быть изготовлены самостоятельно.

Приготовление стандарта мутности

Для получения наиболее широко используемого стандарта McFarland 0,5 Ед смешивают 0,5 мл 1,175% (вес/объем) взвеси двухводного хлорида бария (BaCl2·2H2O) и 99,5 мл 1% (объем/объем) серной кислоты (H2SO4).

Полученную взвесь разливают по 5-6 мл в пробирки, идентичные тем, в которых будет готовиться взвесь бактерий, и тщательно закрывают пробками, герметизируя их при помощи пленки типа «Parafilm» или другим способом, предупреждающим испарение жидкости.

Такой стандарт мутности может храниться до 6 месяцев в темноте при комнатной температуре (22-250С). На пробирки со стандартами необходимо нанести специальные метки, позволяющие контролировать постоянство объема жидкости.

Перед применением стандарт мутности необходимо интенсивно встряхнуть для получения равномерной взвеси хлорида бария. Состав различных вариантов стандарта McFarland приведен в таблице

Состав стандарта мутности McFarland

McFarland Standard No. 0.

5 1 2 3 4

BaCl2·2H2O 1,175%0,5 ml0,1 ml0,2 ml0,3 ml0,4 ml
H2SO4 1%99,5 ml9,9 ml9,8 ml9,7 ml9,6 ml
Концентрация бактерий1,0 × 1083,0 × 1086,0 × 1089,0 × 1081,2 × 109
Пропускание (%)*74.355.635.626.421.5
Поглощение*0.1320.2570.4510.5820.669
*Длина волны 600 нм     
 Для точного приготовления суспензии необходимо использовать специальную карту сравнения. Она может быть приобретена вместе со стандартом или изготовлена самостоятельно.

Контроль стандарта мутности

Для быстрого контроля можно использовать спектрофотометр или нефелометр с кюветой 1 см . Определение пропускания или поглощения света позволяет достаточно точно оценить качество приготовленного эталона.

Альтернативным методом контроля является мерный посев на неселективную среду из разведений контрольного штамма (например E.coli)

Вариант № 1

  1. Вырастить эталонную культуру на агаре Мюллера-Хинтона в течение 18-24 часов при температуре 37 0С.
  2. Приготовить суспензию микроорганизмов в стерильном изотоническом растворе, не допуская образования комков. Уровнять мутность суспензии и стандарта McFarland, добавляя культуру или стерильный физраствор.
  3. В стерильные пробирки разлить по 4,5 мл стерильного изотонического раствора. Подписать пробирки ( от № 1 до № 7)
  4. Тщательно перемешать исходную суспензию и перенести пипеткой 0,5 мл в пробирку № 7.
  5. Тщательно перемешать разведение, 5-10 раз заполняя и опорожняя пипетку. Пипетка при этом все время должна быть погружена в жидкость.

    Не допускается продувания воздуха через жидкость.

  6. Новой пипеткой перенести 0,5 мл из пробирки № 7 в пробирку № 6.
  7. Повторить пп. 5 и 6 для получения необходимого количества разведений.
  8. Подсушить 4 чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки (от № 1 до № 4)
  9. Стерильной пипеткой перенести 0,1 мл жидкости из пробирки № 1 в чашку № 1.

  10. Той же пипеткой 0,1 мл разведения из пробирки № 2 перенести в чашку № 2, из пробирки № 3 – в чашку № 3, из пробирки № 4 – в чашку № 4.
  11. Стерильным стеклянным или металлическим шпателем равномерно распределить жидкость в чашке № 1.
  12. Тем же шпателем распределить жидкость последовательно в чашках №№ 2, 3 и 4.
  13. Инкубировать чашки при 37 0С 18 – 24 часа
  14. Подсчитать количество выросших колоний

Интерпретация полученных результатов основывается на том, что стандарт мутности McFarland 0,5 эквивалентен концентрации микроорганизмов примерно 108 КОЕ/мл.

При правильном приготовлении исходной суспензии и десятикратных разведений на чашке № 3 должно вырастать около 300 колоний. В противном случае в расчет принимается результат, полученный на чашке № 2.

Вариант № 2

  1. Приготовить исходную суспензию и разведения, как указано в пп. 1-7 варианта № 1.
  2. чашки с агаром Мюллера-Хинтона. Подписать чашки от № 1 до № 5
  3. При помощи микродозатора на 20 мкл стерильным наконечником нанести 5 капель из пробирки № 1 на чашку № 1.

    Аккуратным покачиванием распределить капли по поверхности агара, не допуская их слияния.

  4. Повторить п. 3. для остальных разведений.
  5. После полного впитывания жидкости чашки перевернуть и инкубировать в термостате при 37 0С 18 – 24 часа.
  6. Подсчитать количество колоний в каплях.

Стандарты мутности по Мак-Фарланду используются как образцы для приготовления бактериальной суспензии.

Артикул

Название(русское/английское)

Фасовка

Описание

R20421

Cтандарты мутности по Мак-Фарланду в наборе (0.5, 1.0, 2.0, 3.0, 4.0)

1 уп.

Набор содержит по 1 стандарту  0.5, 1.0, 2.0, 3.0 и 4.0, с картой для визуального сравнения при интерпретации;размеры пробирок  15×103 мм

R20410

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 0.5

1 шт.

R20411

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 1.0

1 шт.

R20412

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 2.0

1 шт.

R20413

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 3.0

1 шт.

R20414

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 4.0

1 шт.

R20415

Cтандарт мутности по Мак-Фарланду 5.0

1 шт.

Источник: //www.ld.ru/reviews/ilist-5382.html

Ваш Недуг
Добавить комментарий