Романовского — Гимзы окраска

Окраска по методу романовского-гимза

Романовского — Гимзы окраска

Моментокрашивания:

Готовыйкраситель жидкого вида перед началомокрашивания мазков разводят вдистиллированной воде в соотношении1-2 капель красителя на 1 мг воды. Мазкиокрашиваются во влажной камере притемпературе  37 °C в течение 20-25 минут.После завершения окраски мазки промываютсяв проточной воде, сушатся на воздухе иисследуются с помощью масляных импрессий.

Красящуюсмесь Романовского-Гимзы, в основекоторой имеется краска РомановскогоРайта, растворяют в виде порошка в смесиравноправных объемах глицерина иметилового спирта в соотношении 800 мгкрасителя к 100 мл растворителя.

Красительобладает плохой растворимостью,вследствие чего его следует перетереть с растворителем  в количественномсоотношении 300мг к 100 мг, затем, добавлятькраситель при этом постоянно помешиватьмассу до получения требуемой концентрации.На приготовление красителя требуетсянесколько дней.

Следует акцентироватьвнимание на том, что в качестверастворителей нужно применять химическичистый метиловый спирт и глицерин, таккак именно примеси являются причинойухудшения свойств красителя. 100 % этиловыйспирт может стать идеальной заменойметиловому спирту.

Готовую красящуюсмесь следует хранить в плотно закрытом сосуде в прохладном сухом месте.

Специальныйраствор Гимза.

Составляющиекрасителя:

  • Азур 1 — 3,772 г
  • Эозин — 2,165 г
  • Метиленовая синька (медиц.) — 1,563 г
  • Метанол (ЧДА) — 750,0 мл
  • Глицерин (ЧДА) — 256,0 мл

Методокрашивания

Мазки,акцентированные в метиловом спирте,окрашивают на протяжении 40-120 минутраствором, в состав которого входят 1мл приготовленной краски жидкой формы,2 мл главного буферного раствора и 47 млдистиллированной воды. Используютфосфатный буфер, на рН которого оказываетвлияние вид мазка:

  • мазок костного мозга — 5,8 — 6,0;
  • мазок крови — 6,4 — 6,5;
  • выявление простейших — 6,8;
  • малярийные плазмодия — 7,0 — 7,2.

Ополаскиваниепроводят в дистиллированной воде, затемвысушивают и изучают при иммерсии.

Результатыокрашивания:

АмастиготыLeishmania tropica, находящиеся – в макрофагах.Увеличение 10×100, окрашивание по Гимзе.

Бактериивследствие окрашивания приобретаютфиолетово-красный оттенок, цитоплазмаклеток —  голубой цвет, ядра — красный. Вследствие окраски простейшихих цитоплазма становится голубогоцвета, а ядра — красно-фиолетового

//journal.microbe.ru/files/pdf/2010_103_48.pdf

Материалыи методы В исследованиях использоваливакцинный штамм Y. pestis EV линии НИИЭГ,полученный из ФГУ «48 ЦНИИ МинобороныРФ». Микробную куль- туру, выращеннуюна плотной питательной среде на основегидролизата рыбной муки с добавлениемген- цианвиолета, суспендировали в 0,9 %растворе хло- рида натрия. Оптическуюплотность (ОП) суспензии доводили до1,0 усл. ед.

при длине волны 540 нм. Дляизмерения ОП применяли фотоэлектроколориметрКФК-2 и кюветы длиной оптического пути5 мм. Пробы венозной крови людей получалииз ФГЛУ «Кировская областная станцияпереливания крови», пробы крови отживотных – из питомника ФГУ «48 ЦНИИМинобороны РФ», ФГУП учхоз Вятской ГСХА«Чистые пруды», ФГУ «Кировская областнаястанция по борьбе с болезнями животных».

В каче- стве антикоагулянтов при взятиикрови применяли 3,8 % раствор лимонно-кислогонатрия (1:10) или ге- парин (3 ЕД на 1 мл). Вдень взятия крови эритроци- ты триждыотмывали десятикратным объемом 0,9 %раствора хлорида натрия путемцентрифугирования при 1000 об/мин в течение5 мин и ресуспендирова- ли в этом жерастворе. Конечную концентрацию эри-троцитов доводили до 1,0·1012/л.

В пробиркахсмешивали по 1,0 мл суспензии эри- троцитови по 2,5 мл суспензии бактерий. В качествеконтроля использовали пробы, содержащие:2,5 мл суспензии микробных клеток и 1,0 мл0,9 % раство- ра хлорида натрия; 1,0 млсуспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9 % растворахлорида натрия.

Пробы вы- держивали встатических и динамических условиях(вращающаяся платформа) при (20±1) °С и(37±1) °С в течение 5, 10, 20, 30, 40 и 50 мин, послецентри- фугировали при 1000 об/мин в течение3,0 мин для осаждения эритроцитов. Затемиз проб отбирали на- досадочную жидкостьв объеме 2,0 мл и на КФК-2 определялизначение ее ОП.

Адгезивную способностьбактерий оценивали по введенному намипоказателю адгезии (ПА), кото- рыйрассчитывали по формуле: где ПА –показатель адгезии, Дк1 – ОП надоса-дочной жидкости в контрольной пробе 1,Дк2 – ОП Микробиология, иммунодиагностика,иммунопрофилактика УДК 616.981.452:59В.А.Оборин, Е.В.Пименов, А.Г.

Ивонин Изучениеадгезии бактерий вакцинного штаммаYersinia pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животныхфотоколориметрическим методом ГОУ ВПО«Вятский государственный университет»,Киров С помощью фотоколориметрическогометода изучены адгезивные свойстваклеток вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГв отношении эритроцитов лабораторных,домашних и сельскохозяйственныхживотных.

Установлено, что уровеньадгезии бактерии зависит как от видовойпринадлежности эритроцитов, так и отусловий инкубации микробных иэукариотических клеток. Полученныеданные позволяют предположить, чтовзаимодействие эри- троцитов с Y. pestisимеет определенное значение в развитииинфекционного процесса, обусловленноговозбуди- телем чумы.

Ключевые слова:адгезия, бактерии, вакцинный штамм Y.pestis EV НИИЭГ, эритроциты. МИКРОБИОЛОГИЯ,ИММУНОДИАГНОСТИКА, ИММУНОПРОФИЛАКТИКА49 надосадочной жидкости в контрольнойпробе 2, Доп – ОП надосадочной жидкостив опытной пробе.

В каждой серии опытоввыполняли по три не- зависимых определения;статистическую обработку полученныхданных проводили с помощью компью-терной программы для обработки медицинскойин- формации «Biostat 4.03». Результаты иобсуждение Известно, что при изученииадгезивных свойств бактерий важнымявляется определение оптимальныхусловий их взаимодействия с клетками-мишенями[2, 3, 5].

Поэтому на первом этапе исследованийизучено влияние продолжительностиинкубации проб на уро- вень адгезииклеток Y. pestis EV НИИЭГ к эритроци- тамразличных видов животных. Для этогоэритро- циты морской свинки, белой мыши,барана, лошади и свиньи инкубировалина вращающейся платформе при температуре(37±1) °С в течение различного вре- мени,после чего определяли значения ПА (рис.1).

Как видно из рис. 1, степень адгезиибактерий зависела как от видовойпринадлежности эритро- цитов, так и отпродолжительности совместной ин- кубациимикробных клеток с эритроцитами. В про-веденном эксперименте высокие значенияПА отме- чались в отношении эритроцитовдомашней свиньи, белой мыши, морскойсвинки.

В меньшей степени адгезиябактерий проявлялась к эритроцитамбара- на, и незначительно – к эритроцитамлошади. ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитамсвиньи дости- гал максимального значенияуже после 5 мин инку- бации. Увеличениепродолжительности инкубации микроорганизмовс эритроцитами других животных до 30 минприводило к существенному повышениюуровня адгезии.

При дальнейшем увеличениисрока инкубации роста ПА не регистрировали.Поэтому в последующих исследованияхучет результатов адге- зии предложилипроводить после 30-минутной инку- бациипроб. Далее изучили влияние условийсовместной ин- кубации бактерий сэритроцитами на ПА (рис. 2). При этом пробывыдерживали в статических и ди- намическихусловиях при различных температурныхрежимах.

Адгезия клеток Y. pestis EV НИИЭГ кэритроци- там домашней свиньи не зависелаот температуры и условий инкубации. Вто же время, прикрепление бактерий кэритроцитам других видов животных(морской свинки, белой мыши, барана илошади) наиболее интенсивно происходилопри (37±1) °С на вращающейся платформе.

Следовательно, данные условия инкубацииявляются наиболее подходящи- ми дляоценки адгезии клеток Y. pestis EV НИИЭГ кэритроцитам животных. Выбрав оптимальныережимы инкубации (вы- держивание пробв динамических условиях при (37±1) °С втечение 30 мин), определили значения ПАв отношении эритроцитов, более широкойвидо- вой принадлежности. Результатыэтих исследований приведены в таблице.

Анализируя данные таблицы, эритроцитыраз- личной видовой принадлежностиможно разделить на 3 группы в зависимостиот степени адгезии к ним клеток Y. pestisEV НИИЭГ. К первой группе относят- сяэритроциты белых крыс, домашних свиней,белых мышей, морских свинок, а такжелюдей, для которых ПА составляет свыше60 %.

Вторая группа эритро- цитов (золотистыехомячки, собаки, козы, овцы и ко- ровы)имеет ПА в пределах 40–60 %, третья (лошади,кошки) – ниже 30 %. При сопоставлениирезультатов определения ПА Y. pestis EV НИИЭГк эритроцитам людей и различных видовживотных, с данными ли- тературы по ихвосприимчивости и чувствительности кинфицированию Y.

pestis выявляется следующаязакономерность: чем выше ПА, темвосприимчивее и чувствительнее кзаражению возбудителем чумы являетсявид. Так, у людей и животных, обладающихвысокой восприимчивостью и чувствительностьюк инфицированию Y. pestis, ПА превышает 60%, а жи- вотные с высокой восприимчивостью,но низкой и средней чувствительностьюПА находится на уровне 40–60 %.

В то жевремя, у животных, имеющих ПА ниже 30 %отмечается низкая восприимчивость иличувствительность к инфицированиювозбудителем чумы. Исключение составляютсобаки, которые за- Рис. 1. Динамикаизменения ПА Y. pestis EV НИИЭГ к эритроцитамживотных при различной продолжительностиинкубации проб Рис. 2. Динамика измененияПА Y.

pestis EV НИИЭГ к эритроцитам животныхпри различных условиях инкубации пробПроблемы особо опасных инфекций, вып.103, 2010 50 нимают промежуточное положениемежду первой и второй группой, так каку них ПА ниже 60 %, но они, являясьвосприимчивыми к заражению, обладаютнизкой чувствительностью. Таким образом,проведенные исследования по- казали,что клетки Y.

pestis EV НИИЭГ обладаютспособностью прикрепляться к эритроцитамлюдей и животных. При этом установлено,что уровень ад- гезии бактерий зависитот видовой принадлежно- сти эритроцитови от условий их взаимодействия. Выявлено,что эритроциты ряда животных прояв-ляют свою способность фиксироватьбактерии в определенных условиях, чтоможет быть обусловле- но как морфологическими,так и функциональными различиямирецепторного аппарата эритроцитов раз-личных видов млекопитающих. Экспериментальнымпутем выбраны оптимальные условия,позволяющие выявлять потенциальнуюспособность эритроцитов фиксироватьна своей поверхности бактерии иссле-дуемого штамма. Сравнение полученныхрезультатов с данными литературы повосприимчивости и чувствительности кзаражению возбудителем чумы человекаи разных видов животных позволяетсделать предположение о том, чтоэритроциты играют определенную роль ввосприимчивости к инфицированию Y.pestis и реа- лизации инфекционного процессапри чуме.

Источник: //studfile.net/preview/5623449/

Способ окраски по Романовскому – Гимзе

Романовского — Гимзы окраска

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Данный способ окраски применяют для изучения простейших, а также спирохет и риккетсий. Используемая краска состоит из смеси азура, эозина, мителенового синего.

Непосредственно перед употреблением её растворяют дистиллированной или проточной водой (рН 7,0 – 7,2) из расчета 1:10. Препарат фиксируют этиловым или метиловым спиртом в течение 5-15 минут, окрашивают 30-40 минут, высушивают и микроскопируют.

Ядро простейших, жгутики и блефаропласт окрашиваются в ярко-синий цвет, цитоплазма – в голубой, спирохеты и риккетсий – в сиреневато-синий.

Окраска по Бурри – Гинсу (выявление капсул).

Этот метод назван негативным, так как окрашивается фон препарата и бактериальная клетка, а капсула остается неокрашенной.

1. На предметное стекло наносят каплю чёрной туши, разведённой в 10 раз. В неё вносят каплю культуры. Ребром шлифованного стекла делают мазок, также как мазок крови и высушивают.

2. Фиксирую спиртом или сулемой. Осторожно промывают водой.

3. Окрашивают фуксином Пфейфера 3-5 минут. Осторожно промывают и высушивают на воздухе. Микроскопия препаратов проводится с помощью иммерсионной системы. Фон препарата – черный, клетки – красные, капсулы – не окрашены.

а) Шаровидные бактерии:

1-стафилококки (окраска по

Грамму)

2-стрептококки (окраска по

Грамму)

3-пневмококки (окраска по Бури-

Гинсу)

4-менингококки и гонококки

(окраска по Грамму)

б) Палочковидные бактерии:

1-кишечные палочки (окраска по

Грамму)

2-возбудитель дифтерии (окраска

мителеновым синим)

3-Возбудитель туберкулёза (окраска

по Цилю-Нильсену)

4-возбудитель столбняка (окрска по

Ожешко)

5-холерный вибрион (окраска по

Грамму)

в) Спирохеты:

1- бледная трепонема

2-спирохета возвратного тифа

3-лептоспиры

Методы приготовления мазков – препаратов из

Материала (культур)

И способы их окрашивания.

Мазки-препараты готовят из патологического материала (например, из гноя, мокроты, фекалий), колоний или из налёта чистых культур бактерий, и грибков, выросших на питательных средах в чашках Петри или пробирках.

Делают мазки на предметных стёклах, как правило, бактериальной петлей (диаметр 3×2 мм) из нихромовой проволоки, конец которой закрепляют зажимом в специальном петледержателе или впаивают в стеклянную палочку.

Для изготовления мазков необходима газовая горелка или спиртовка, ванночка с подставкой (мостик) для стёкол, промывалка с водой, флакон с физиологическим раствором, красители, фильтровальная бумага, банки с дезинфицирующим раствором для обезвреживания отработанных препаратов, пипеток, материалов и рабочего стола.

Этапы приготовления мазка:

1. Исследуемые материалы и культуры микробов берут бактериальной петлёй, которую стерилизуют в пламени горелки. При введении петли в пробирки и колбы стерилизуют также верхнюю часть петледержателя.

Края горлышка пробирки стерилизуют в пламени горелки и почти одновременно обжигают петлю, которую быстро вводят внутрь пробирки, охлаждают и прикасаются к налёту на скошенном питательном агаре или же погружают её в культуру.

Затем петлю извлекают, быстро обжигают край пробирки и, закрывают пробкой и ставят пробирку в штатив.

2. Налёт чистой культуры микробов или колонию эмульгируют в капле воды на предметном стекле и круговыми движениями петли равномерно распределяют на площади 1,0 – 1,5 см. Точно такого же размера готовят мазок из бульонной культуры, гноя, мокроты и др.

материалов, которые не взвешиваются в воде.

Хорошо приготовленные мазки имеют округлую форму, быстро высыхают при комнатной температуре, более толстые -высушивают в термостате или подогревают над пламенем горелки, не допуская свёртывания белка бактерий и нарушения их структуры.

3. Высушенные мазки фиксируют 5 – 6 секунд в пламени спиртовки для того, чтобы убить микробов, закрепить их на предметном стекле и предотвратить смыв при ополаскивании во время окраски мазка.

Для приготовления мазков из гноя и мокроты, вязких консистенций пользуются двумя предметными стеклами. На середину одного из них наносят небольшое количество материала, который покрывают вторым стеклом так, чтобы осталась свободной треть первого и второго стекол. Раздвигают стекла в стороны, получают два больших мазка одинаковой толщины.

Мазки из крови готовят следующим образом. Стерильной иглой для инъекций делают укол на предварительно продезинфицированном безымянном пальце левой руки. Первую каплю крови удаляют ватой, вторую наносят на край хорошо обезжиренного предметного стекла. Мазки делают узким шлифовальным стеклом, установленным под углом 45 градусов, продвигая его вдоль предметного стекла влево, не доходя до края.

Препараты-отпечатки из внутренних органов трупов, мяса, колбасных изделий, получают, прикасаясь предметным стеклом к поверхности разрезов, выполненных стерильным скальпелем.

4. Фиксированные мазки окрашивают кислыми, щелочными и нейтральными анилиновыми красителями. Наиболее широкое применение нашли – основной и кислый фуксин, метиленовый синий, генцианвиолет и везувин.

Простой способ окраски мазков производится водным фуксином Пфейффера и метиленовым синим Леффлера. Готовят водный фуксин из фенолового фуксина Циля, разводят его дистиллированной водой.

После окрашивания красители сливают, препарат промывают водой и высушивают между листами фильтровальной бумаги. На сухой мазок наносят каплю масла и микроскопируют с использованием иммерсионного

объектива оптического микроскопа. Способность микробов воспринимать красители называется тинкториальными свойствами.

При сложных методах окраски мазков применяют два-три различных по цвету красителя, что позволяет дифференцировать микробы и выявить некоторые нюансы в деталях их строения. К таким методам относят окраску по Грамму, Цилю – Нельсену, Нейссеру, Бурри – Гинсу, Романовскому – Гимзе и некоторые другие.

Мазок для люминесцентной микроскопии готовят обычным образом, фиксируют в ацетоне 5-10 минут и наносят на него флюорохром на 20- 30 минут. Сделанный препарат 15-20 минут промывают проточной водой, покрывают покровным стеклом и микроскопируют.

Для электронной микроскопии вместо предметных стёкол применяются тонкие плёнки-подложки, незначительно поглощающие электроны.

Они крепятся на опорные сетки. Исследуемый материал, тщатеьно

очищенный от различных примесей, наносят на плёнку.

Высушенный препарат микроскопируют.

Контрольные вопросы.

1. Как приготовить мазок препарата?

2. Назовите цели и способы фиксации мазков?

3. Назовите основные красители?

4. Какими методами изучают подвижность микроорганизмов?

5. Назовите и охарактеризуйте сложные методы окрашивания?

ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА №4

Способы сбора материала

Кровь (ранняя диагностика)   В количестве 10-20 мл берут стерильным шприцем из локтевой вены изасевают у постели больного во флаконы с элективной средой (среда Раппопорт или 10-20% желчный бульон). Во флаконы со средой Раппопорт помещают поплавок, в который попадает образовавшийся газ, что позволяет предположить накопление в среде возбудителей паратифов. Флаконы с посевом ставят в термостат. Наследующий день посевы вынимают из термостата, просматривают и, независимо от внешне выраженных признаков роста, производят высев на плотные среды Эндо и Плоскирева. При отсутствии роста флаконы оставляют в термостате еще на 7 дней. Отсутствие роста после 7-го дня позволяет дать отрицательный ответ. Культура, выделенная из крови, называется гемокультурой.  
Испражнения (исследование с первых дней заболевания и до выписки из стационара)   3-5 г испражнений помещают в баночку или пробирку с 30% глицериновой смесью. Производят посев на дифференциальные среды Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар или на одну из сред обогащения (селенитовую, Мюллера или Кауфмана) с последующим (через 24 ч) высевом на дифференциальные среды. Таким образом, посев на эти среды производят дважды с интервалом в I день. Сохранять собранный материал в глицериновой смеси можно 6-8 ч (лучше на холоде).
Моча (исследование с первых дней заболевания)   Мочу лучше брать стерильно катетером. При отсутствии такой возможности делают так: до взятия мочи наружное отверстие мочеиспускательного канала обмывают изотоническим раствором натрия хлорида. 1-ю порцию мочи сливают. После этого 20-50 мл мочи собирают в стерильную посуду и центрифугируют или отстаивают. Производят посев осадка на дифференциальные среды Эндо, Плоскирева, висмут-сульфитный агар и на одну из сред обогащения – селенитовую, Мюллера или Кауфмана с последующим (через 24 ч) пересевом на дифференциальные среды. Посевы ставят в термостат. На следующий день при наличии подозрительных колоний выделяют чистую культуру. Далее по общей схеме.
Содержимое розеол   Участок кожи с выраженными розеолами протирают спиртом, промывают изотоническим раствором натрия хлорида и стерильным скальпелем скарифицируют поверхность розеол. На скарифицированный участок кожи наносят каплю 10-20% желчного бульона, который смешивается с содержимым розеол. Несколько капель этой смеси насасывают пастеровской пипеткой. Тонкий конец пипетки запаивают и отсылают в лабораторию.
Дуоденальное содержимое Исследование желчи можно производить на любом этапе заболевания. Желчь собирают натощак путем дуоденального зондирования в стерильные пробирки, раздельно порции А, В и С. Посев можно производить из отдельных порций и из их смеси. Полученную желчь инкубируют в термостате. На следующий день производят посев на дифференциальные среды. При отсутствии роста после первого высева желчь оставляют в термостате на 10 дней, периодически производят высевы через дня.
Рвотные массы Если рвотные массы густой консистенции, их разводя изотоническим раствором натрия хлорида в соотношении 1:10.2-3 капли из верхнего слоя засевают на дифференциальные среды обогащения. Далее по общей схеме. Промывные воды желудка и рвотные массы исследуют обычно при токсикоинфекциях. Они, как правило, имеют кислую реакцию поэтому перед, посевом их нейтрализуют 5-10% раствором бикарбоната натрия (питьевая сода).
Пищевые продукты   Жидкие или полужидкие продукты тщательно размешивают, 2-3 капли засевают на дифференциальные среды и среды обогащения. При исследовании плотных продуктов стерильным шпателем ил ножом берут 5-10г из глубины, эмульгируют в изотоническом растворе натрия хлорида в соотношении 1:5 или 1:10 и засеваю на дифференциальные среды и среды обогащения При вырастании подозрительных колоний дальнейшее исследование ведут по общей схеме.

ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ

Питательные среды широко применяются в микробиологической практике для выращивания разных микроорганизмов с исследовательской целью, для диагностики инфекционных заболеваний, для получения из микробов различных продуктов жизнедеятельности (токсинов, антибиотиков) и т. д.

Любая питательная среда должна отвечать следующим требованиям: содержать все необходимые для роста и размножения микроба вещества в легко усвояемой форме, быть изотоничной, иметь оптимальную влажность, вязкость, рН, оптимальный окислительно-восстановительный потенциал, быть стерильной и прозрачной.

Питательные среды готовят из естественных продуктов животного и растительного происхождения (мяса, молока, сыворотки крови, дрожжей и др.) или искусственно полученные из этих продуктов веществ (пептона, дрожжевого экстракта и др.), или химически чистых соединений с точно известным составом (аминокислоты, углеводы, витамины, минеральные соли).

Большое значение имеет наличие в составе питательных сред факторов роста. К ним относятся витамины, пуриновые и пиримидиновые основания, аминокислоты.

В бактериологической практике чаще всего используют питательные среды комбинированного состава. Многие питательные среды выпускаются в виде порошка. Для приготовления питательной среды его растворяют в кипящей воде. По целевому назначению питательные среды можно разделить на основные, дифференциально-диагностические и элективные.

К основным относятся мясо-пептонный бульон и агар, которые применяются для выращивания многих патогенных и непатогенных гетеротрофных бактерий. При приготовлении элективных сред ставится задача создать максимально благоприятные условия для роста микроба одного вида,

Целевое назначение дифференциально-диагностических сред состоит в возможности распознания отдельных видов бактерий по их ферментативным свойствам.

Все большее значение приобретают синтетические питательные среды, приготовленные из растворов химически чистых органических и неорганических соединений. По консистенции питательные среды могут быть жидкими, плотными и полужидкими. Для получения плотных и полужидких сред к ним добавляют агар-агар.

Последний представляет собой продукт переработки особого вида морских водорослей и в застывшем состоянии придает среде плотность. Для приготовления плотных сред добавляют- 2,5%-агар-агара, а для получения полужидких 0,15 – 0,7%. В некоторых случаях для получения плотных питательных сред используют желатин.

Такие среды, как свернутая сыворотка крови, свернутый яичный белок, сами по себе являются плотными.

⇐ Предыдущая12345678910Следующая ⇒

Дата добавления: 2017-02-25; просмотров: 2687 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов

Источник: //lektsii.org/15-2198.html

Окраска мазков

Романовского — Гимзы окраска

ПРИГОТОВЛЕНИЕ МАЗКОВ

Методы подсчета лейкоцитарной формулы

Лейкоцитарная формула – это процентное соотношение различных видов лейкоцитов. Подсчитывается при микроскопии окрашенных мазков крови или в гематологических анализаторах.

Мазки крови готовят на предметных стеклах, которые предварительно моют и обезжиривают.

Подготовка стекол. Стекла (новые и бывшие в употреблении) замачивают на 8-10 часов в 2% растворе хозяйственного мыла или СМС в эмалированной посуде, кипятят в этом же растворе 5-10 минут.

Более длительное кипячение и использование алюминиевой посуды не рекомендуется, так как приводит к помутнению стекол. Промывают стекла в проточной воде, насухо вытирают и помещают для обезжиривания на 30-60 минут в смесь Никифорова (спирт 96% и диэтиловый эфир в соотношении 1:1).

Насухо вытирают чистой тканью и хранят в закрытой чистой посуде.

Приготовление мазков. Мазок крови делается с помощью шлифованного стекла с идеально ровным краем, ширина которого должна быть на 2-3мм меньше, чем у предметного стекла. После прокола пальца первую каплю удаляют сухим ватным тампоном.

К куполу следующей капли прикасаются предметным стеклом на расстоянии 1,5-2см от края стекла. К коже в месте прокола не прикасаться! Капля крови на предметном стекле должна иметь диаметр 2-3мм.

Шлифованное стекло ставят под углом 45º на 1-2мм перед каплей и двигают его назад к капле так, чтобы вся кровь растеклась по краю шлифованного стекла. Быстрым легким движением делают мазок, пока не кончится вся капля крови. Высушивают мазки на воздухе.

Маркируют их простым карандашом, обозначая на толстой части мазка фамилию и инициалы пациента или его регистрационный номер. Делают не менее двух мазков.

Требования к мазку. Правильно приготовленный мазок должен быть:

– равномерной толщины, полупрозрачным, желтоватого цвета;

– достаточной величины – занимать ½ – ¾ длины предметного стекла, отступив от края на 1-1,5см;

– оканчиваться «метелочкой».

Толстые мазки для исследования не пригодны, так как клетки в них располагаются в несколько слоев и деформируются. В правильно приготовленных тонких мазках клетки располагаются в один слой.

Готовые высушенные мазки крови фиксируют, а затем окрашивают. В неокрашенном виде мазки сохраняются при комнатной температуре в течение 3 дней.

Фиксация мазков предохраняет элементы крови от воздействия содержащейся в красках воды, под влиянием которой в нефиксированных мазках происходит разрушение эритроцитов и изменяется морфология лейкоцитов. Фиксация также вызывает коагуляцию белков и закрепляет мазок на стекле. Фиксацию проводят либо в специальной кювете, либо в широкогорлой банке с хорошо закрывающейся крышкой.

Для фиксации используют следующие реактивы:

– метиловый спирт – время фиксации 3-5 минут;

– раствор эозинметиленового синего по Май-Грюнвальду (фиксация 3 минуты);

– этиловый спирт (фиксация 20-25 минут);

– смесь Никифорова (фиксация 30 минут).

Фиксированные мазки высушивают на воздухе и окрашивают.

Окраска мазков. Проводится в специальных кюветах или на «мостике». В качестве унифицированных приняты 3 метода окраски мазков крови:

– по Романовскому-Гимзе;

– по Нохту;

– по Паппенгейму.

Принцип окраски мазков крови.Основу современных методов окраски клеток крови заложил русский врач Д.Л. Романовский, который в конце 19 века предложил окрашивать препараты одновременно двумя красителями – щелочной и кислой реакции.

Различные клеточные структуры имеют разную рН и связываются с красителем противоположной реакции. Ядра клеток богаты нуклеиновыми кислотами, имеют кислую реакцию и окрашиваются красителями щелочной реакции (метиленовым синим, азуром I и II) в сине-фиолетовый цвет.

Цитоплазма гранулоцитов, зернистость эозинофилов, эритроциты содержат щелочные белки, поэтому окрашиваются красителем кислой реакции (эозином) в розовый цвет.

Окраска по Романовскому-Гимзе

Реактив: готовая краска Романовского. В её состав входит азур-II (смесь равных частей азура-I и метиленового синего) и эозин. Заводская краска очень концентрированная и перед употреблением её нужно разводить. Степень разведения и время окраски определяется опытным путем и называется титрование краски Романовского.

Титрование краски Романовского. Готовят три разведения краски из расчета: 1, 2 и 3 капли красителя на 1мл дистиллированной воды. Каждым из разведений окрашивают 5 зафиксированных мазков в течение 20, 25, 30, 35 и 40 минут. На каждом мазке отмечают время окраски и разведение красителя.

После окрашивания микроскопируют мазки и определяют разведение и время, при которых получена наилучшая окраска. Эти условия, соответствующие лучшему окрашиванию, указывают на этикетке бутыли с краской. Например: титр краски – 1капля/мл; экспозиция – 30 минут.

Титрование краски Романовского проводят один раз перед использованием каждой новой партии красителя.

Ход окраски.В специальную кювету для окрашивания наливают раствор краски Романовского, приготовленный непосредственно перед использованием в соответствии с установленным титром. В рабочий раствор красителя опускают штатив с сухими фиксированными мазками. Красят мазки в соответствии с выбранной экспозицией. Промывают мазки проточной водой и высушивают на воздухе.

Источник: //studopedia.su/13_46509_okraska-mazkov.html

ПОИСК

Романовского — Гимзы окраска

    Краситель Романовского—Гимзы [c.343]

    Краситель Романовского— Гимзы состоит из метиленового синего, эозина и азура, благодаря чему он окрашивает в разные цвета элементы микроорганизма и форменные элементы крови.

Перед обработкой препарата краситель разводят водой (pH 7,0 — 7,2) в 10 — 20 раз. Степень разведения меняется в зависимости от серии красителя и pH воды. Поэтому рекомендуют каждую новую серию красителя и воду проверять на контрольных мазках крови. [c.

20]

    Краситель Романовского — Гимзы, имеющий в растворе сине-фиолетовый цвет, окрашивает цитоплазму форменных элементов ткани в голубовато-синий цвет, а ядра клеток, так же как и микробные тела, в фиолетово-красный (см. рис. 30). [c.32]

    Толстую каплю независимо от способа приготовления высушивают постепенно (не на солнце и без подогрева) и не фиксируют. Окрашивают спустя несколько часов после взятия крови 4 — 5%-м водным раствором красителя Романовского — Гимзы в течение 20—25 мин. [c.342]

    Окраска по Романовскому — Гимзе. Краситель Романовского—Гимзы состоит из смеси азура, эозина и метиленового синего.

Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды (pH 7,0—7,2) прибавляют 10 капель имеющегося в продаже красителя Романовского — Гимзы. Приготовленный раствор красителя тотчас наливают на фиксированный мазок или предметное стекло с окрашиваемым.

препаратом погружают в стаканчик с красителем. Через час краситель сливают, препарат промывают водой и высушивают па воздухе. [c.32]

    Метод Романовского-Гимза. Этим методом в клетках микроорганизмов одновременно выявляют ядерные вещества и волю-тин. Препарат фиксируют 5 мин метиловым спиртом или фиксатором Карнуа.

В последнем случае для удаления следов уксусной кислоты препарат промывают спиртом и тщательно высушивают на воздухе. Окрашивают, препарат красителем Романовского-Гимза в течение суток, затем ополаскивают слабощелочной (pH 7,2) водой, высушивают и микроскопируют.

Ядерные вещества окрашиваются в красно-фиолетовый цвет, цитоплазма – в слабо-розовый. [c.35]

    Микроскопия. У больного во время приступа или перед повторным приступом берут кровь из пальца и готовят препарат толстой капли и мазок. Вначале окрашивают препарат толстой капли, так как при его исследовании больше вероятности получить положительный результат.

На высушенный нефиксированный препарат капли крови наливают на 35 — 45 мин краситель Романовского—Гимзы, затем препарат осторожно промывают водой и высушивают. Под микроскопом боррелии имеют вид тонких нитей сине-фиолетового цвета с несколькими большими неравномерными завитками (см. цв. вклейку, рис.

24). [c.233]

    Широко применяется окраска по Романовскому—Гимзе. Фиксированные мазки заливают свежим красителем Романовского — Гимзы на 25 — 45 мин (в зависимости от температуры воздуха в помещении). Для ускорения окраски можно подогревать краситель до 60 —70°С, не допуская закипания( ). Мазки промывают струей воды и сушат в вертикальном положении. [c.341]

    Приготовление микропрепаратов. На чистом обезжиренном стекле готовят мазок и подсушивают на воздухе. Полученный препарат фиксируют метиловым, абсолютным этиловым спиртом или смесью Никифорова в течение 5 мин либо охлажденным безводным ацетоном в течение 3 — 5 мин. После фиксации высушенные мазки окрашивают свежеприготовленным красителем Романовского — Гимзы в течение 1 ч, затем мазок быстро промывают 96%-м этиловым спиртом для удаления избытка красителя, высушивают и микроскопируют с использованием иммерсионной системы при увеличении 900—1500х. [c.244]

    Окраска по Романовскому— Гимзе в модификации Филипсона. Смешивают ] часть красителя Романовского —Гимзы и 3 части 95%-го этилового спирта.

Нефиксированные мазки заливают этой смесью на 1,0 — 1,5 мин, затем, не сливая краски, осторожно по каплям добавляют такое же количество дистиллированной воды, не допуская, чтобы жидкость сливалась со стекла.

Через 20 — 30 мин мазки промывают водой и высушивают. [c.341]

    Краситель Романовского-Гимза. Промышленность выпускает препарат из смеси азура (органический краситель, полученный из метиленового синего), эозина и метиленового синего. Непосредственно перед употреблением к 10 мл дистиллированной воды, имеюш,ей нейтральную или слабош,елочную реакцию (pH 7,2), прибавляют десять капель красителя. [c.35]

    Окраска по Романовскому — Гимзе в модификации Филипсона. Смешивают 1 часть красителя Романовского — Гимзы и 3 части 95%-го этилового спирта. Нефиксированные мазки заливают этой смесью на 1,0 — [c.341]

Смотреть страницы где упоминается термин Краситель Романовского — Гимзы: [c.105]    [c.50]    Смотреть главы в:

Микробиология с техникой микробиологических исследований изд.4 -> Краситель Романовского — Гимзы

Романовского

© 2019 chem21.info Реклама на сайте

Источник: //www.chem21.info/info/1894325/

Ваш Недуг
Добавить комментарий