Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования — способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине этими методами изучают строение микроско­пических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза че­ловека.

Основу микроскопических методов ис­следования составляют СМ и ЭМ. СМ имеет несколько разновидностей, каждая из которых использует различные свойства света: фазово-контрастная, интерференционная, люми­несцентная, поляризационная, стереоскопи­ческая, ультрафиолетовая, инфракрасная.

В ЭМ изображение объектов исследования возникает в результате направленного потока электронов.

Световая микроскопия

СМ основывается на таких определяющих факторах, как разрешающая способность мик­роскопа, направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, кото­рый может быть прозрачным и непрозрачным.

В зависимости от свойств объекта изменяют­ся физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой вол­ны, фаза, плоскость и направление распрост­ранения волны. Для СМ биологические объек­ты обычно окрашивают для выявления тех или иных их свойств.

При этом ткани должны быть фиксированы, так как окраска выявляет опре­делённые структуры только погибших клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает клеточные структуры.

Тем не менее в СМ мож­но изучать и живые биологические объекты (витальная микроскопия). В этом случае при­меняют тёмнопольный конденсор.

Фазово-контрастная микроскопияприменяется для исследования живых и неокрашенных био­логических объектов.

Она основана на диф­ракции луча света в зависимости от особенно­стей объекта изучения, от которых зависит изменение длины и фазы световой волны.

В патологии фазово-контрастная микроскопия находит применение при исследовании про­стейших, клеток растений и животных, при подсчёте и дифференцировке клеток костного мозга и периферической крови, при изучении клеток культуры тканей и др.

Поляризационная микроскопияпозволяет изучать биологические объекты в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимно перпендикулярных плоскостях, т.е. в поляри­зованном свете.

Этого достигают с помощью плёнчатых поляроидов или призм Николя, ко­торые помещают в микроскопе между источ­ником света и препаратом. Поляризация меня­ется при прохождении (или отражении) лучей света через различные и оптически разнород­ные структуры.

В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляри­зованного света не зависит от плоскости поля­ризации, а в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или попереч­ной оси объекта.

Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двой­ное лучепреломление, при обратных взаимоот­ношениях — отрицательное двойное лучепре­ломление.

Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, яв­ляются анизотропными и обладают положитель­ным двойным лучепреломлением. Такими свой­ствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, коллагеновые волокна и др.

Сопоставление характера лучепреломления поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной орга­низации его структуры. Поляризационная мик­роскопия является одним из гистологических, а также цитологических методов исследова­ния, способом микробиологической диагнос­тики и др. Важно, что в поляризованном све­те можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные (нативные) срезы тканей.

Люминесцентная микроскопияоснована на свойстве многих веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фи­олетовой части спектра света.

Ряд биологичес­ких веществ, таких как простые белки, коферменты, некоторые витамины, лекарственные средства (ЛС) обладают собственной (первич­ной) люминесценцией. Другие вещества начи­нают светиться при добавлении к ним специаль­ных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция).

Флюорохромы могут распре­деляться в клетке диффузно, но могут избира­тельно окрашивать отдельные клеточные струк­туры или определённые химические соединения. На этом основано использование люминесцен­тной микроскопии в цитологических и гисто­химических исследованиях.

Иммунофлюоресценция в люминесцентном микроскопе позволяет выявлять различные Аг и их концентрацию в клетках, при этом возможна идентификация вирусов, определение AT и иммунных комплек­сов, гормонов, различных продуктов метаболиз­ма и др.

//www.youtube.com/watch?v=NIRCkWaysjE

Люминесцентную микроскопию применяют для диагностики вирусных инфекций, с помо­щью вторичной люминесценции диагностиру­ют злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют оча­ги ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т. д.

Ультрафиолетовая и инфракрасная микроско­пияоснована на способности поглощения УФ- и инфракрасных лучей определённых длин волн некоторыми веществами, входящими в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных тканей, прозрачных в видимом свете.

Свойством по­глощать УФ-лучи обладают высокомолекуляр­ные соединения, такие как нуклеиновые кис­лоты, белки, ароматические аминокислоты (тирозин, триптофан, метилаланин), пуриновые и пиримидиновые основания и др. С по­мощью УФ-микроскопии изучают локализа­цию и количество таких веществ, а при исследовании живых объектов — их измене­ния в процессе жизнедеятельности.

Инфра­красная микроскопия применяется в медицине преимущественно в нейроморфологии и офтальмологии.

Для специальных целей в патологии исполь­зуются и другие микроскопические методы — интерференционная, стерео­скопическая микроскопия и др.

Электронная микроскопия

ЭМ применяют для изучения структуры клеток, микроорганизмов и вирусов на субклеточном и макромолекулярном уровнях. Значительную раз­решающую способность ЭМ обеспечивает по­ток электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электро­магнитными линзами.

При трансмиссионной ЭМ электроны проходят через структуры ис­следуемого объекта, а при сканирующей ЭМ они отражаются от этих структур, отклоняясь под разными углами. В результате возникает изображение на люминесцирующем экране микроскопа.

При трансмиссионной (просве­чивающей) ЭМ получают плоскостное изобра­жение внутриклеточных структур, при скани­рующей — объёмное. Весьма полезно сочетание ЭМ с другими методами — авторадиографией, гистохимическими, иммунологическими мето­дами.

Возникает возможность наблюдать тече­ние биохимических и иммунологических про­цессов в клетке в сочетании с изменениями внутриклеточных структур. ЭМ требует специальной химической или фи­зической фиксации тканей. Для исследования берут в основном биопсийный материал.

Мо­жет быть использован и секционный матери­ал, но в максимально короткие сроки после смерти, обычно исчисляемые минутами. Пос­ле фиксации ткани обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на ультратомах. При этом получают ультратонкие срезы тканей толщи­ной 30—50 нм. Их контрастируют, переносят на специальные металлические сетки и затем изучают в ЭМ.

При ультратомировании препарата можно полу­чить так называемые полутонкие срезы толщи­ной 1,5 мкм, которые после окраски метиленовым синим исследуют в СМ. Это позволяет получить представление о состоянии той ткани, клетки которой будут затем изучены в ЭМ. Ме­тод может иметь и самостоятельное значение.

В сканирующем (растровом) ЭМ исследуют по­верхность биологических и небиологических объектов, напыляя в вакуумной камере на их поверхность электроноплотные вещества и изу­чая эти реплики, повторяющие контуры объек­та исследования.

Методы окрашивания

Микроскопические методы используют в ме­дицине в сочетании с гистологическими методами исследования клеток и тканей. Для это­го, как правило, фиксированные тканевые срезы должны быть окрашены с целью выявле­ния различных клеточных структур. Последние воспринимают красители в зависимости от их физико-химических свойств. Поэтому красители подразделяют на основные, кислые и ней­тральные.

Основные, или базофильные, красители являют­ся красящими основаниями или их солями (ге­матоксилин, метиленовый синий, толуидиновый синий и др.). В цветовой гамме этих красителей преобладают оттенки синего цве­та. Интенсивность окраски (базофилия) зави­сит от числа кислотных групп в структурах клетки, способных взаимодействовать с основными красителями.

Кислые, или ацидо­фильные, красители — красящие кислоты или их соли, окрашивающие клеточные структу­ры в различные оттенки красного (эозин, эритрозин, Конго красный, оранж и др.). Ней­тральные, красители содержат и базофильные, и ацидофильные вещества (например, смесь Романовского—Гимзы).

Такие красители мо­гут обладать способностью растворяться в оп­ределённых веществах, окрашивая их (судан III, шарлах и др.). Нередко для контрастиро­вания структур клеток или тканей использу­ют методы, основанные на способности этих тканей удерживать или восстанавливать соли тяжёлых металлов (серебра, золота, осмия, свинца и др.).

Эти методы контрастирования называются импрегнацией, они используются как в СМ, так и в ЭМ.

С помощью различных красителей в повседнев­ной и научной практике применяют обзорные окраски для составления общего представле­ния о состоянии исследуемой ткани (гематок­силин и эозин, азур-фукселин и др.

), а также специальные окраски для выявления особен­ностей процессов, протекающих в тканях и клетках. Так, используют окраску Суданом III для выявления жировой дистрофии клеток, Конго красным — для определения отложений амилоида, импрегнацию серебром — для ис­следования нервной ткани и т.п.

Живые и нео­крашенные объекты исследуют с помощью специальных микроскопических методов, опи­санных выше.

Гистохимические методы

Гистохимические и гистоферментохимические методы позволяют проследить и оценить об­мен веществ в тканях и клетках в норме и вусловиях патологии; избирательно оценить метаболизм белков, липидов, углеводов и дру­гих метаболитов, локализацию и активность ферментов и гормонов, проанализировать осо­бенности окислительно-восстановительных процессов, протекающих в клетках и тканях в условиях патологии, при приспособлении и компенсации. Диапазон применения гистохи­мических методов в патологии необычайно широк. Для гистохимических исследований используют срезы свежезамороженных тканей, приготовленные в криостате, что позволяет сохранить прижизненную локализацию того или иного химического соединения. Гистохи­мические методы часто сочетают с другими методами СМ и ЭМ. Для количественной оцен­ки результатов гистохимических реакций при­меняют гистофотометрию, цитофотометрию, микрофлюорометрию и др.



Источник: //infopedia.su/4x4668.html

Микроскопические методы исследования – это… Что такое Микроскопические методы исследования?

Микроскопические методы исследования
способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет световая и электронная микроскопия.

В практической и научной деятельности врачи различных специальностей — вирусологи, микробиологи, цитологи, морфологи, гематологи и др. помимо обычной световой микроскопии используют фазово-контрастную, интерференционную, люминесцентную, поляризационную, стереоскопическую, ультрафиолетовую, инфракрасную микроскопию. В основе этих методов лежат различные свойства света.

При электронной микроскопии изображение объектов исследования возникает за счет направленного потока электронов. Для световой микроскопии и основанных на ней других М.м.и. определяющее значение помимо разрешающей способности Микроскопа имеет характер и направленность светового луча, а также особенности изучаемого объекта, который может быть прозрачным и непрозрачным.

В зависимости от свойств объекта изменяются физические свойства света — его цвет и яркость, связанные с длиной и амплитудой волны, фаза, плоскость и направление распространения волны. На использовании этих свойств света и строятся различные М.м.и. Для световой микроскопии биологические объекты обычно окрашивают с целью выявления тех или иных их свойств (рис. 1).

При этом ткани должны быть фиксированы, т.к. окраска выявляет определенные структуры только убитых клеток. В живой клетке краситель обособляется в цитоплазме в виде вакуоли и не прокрашивает ее структуры. Однако в световом микроскопе можно изучать и живые биологические объекты с помощью метода витальной микроскопии. В этом случае применяют темнопольный конденсор, который встраивают в микроскоп.

Для исследования живых и неокрашенных биологических объектов используют также фазово-контрастную микроскопию. Она основана на дифракции луча света в зависимости от особенностей объекта излучения. При этом изменяется длина и фаза световой волны. Объектив специального фазово-контрастного микроскопа содержит полупрозрачную фазовую пластинку.

Живые микроскопические объекты или фиксированные, но не окрашенные микроорганизмы и клетки из-за их прозрачности практически не изменяют амплитуду и цвет проходящего через них светового луча. вызывая лишь сдвиг фазы его волны. Однако, пройдя через изучаемый объект, лучи света отклоняются от полупрозрачной фазовой пластинки.

В результате между лучами, прошедшими через объект, и лучами светового фона возникает разность длины волны. Если эта разность составляет не менее 1/4 длины волны, то появляется зрительный эффект, при котором темный объект отчетливо виден на светлом фоне или наоборот в зависимости от особенностей фазовой пластинки.

Разновидностью фазово-контрастной микроскопии является амплитудно-контрастная, или аноптральная, микроскопия, при которой применяют объектив со специальными пластинками, изменяющими только яркость и цвет фонового света. В результате расширяются возможности исследования живых неокрашенных объектов.

Фазово-контрастная микроскопия находит применение в микробиологии и паразитологии при исследовании микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных; в гематологии для подсчета и определения дифференцировки клеток костного мозга и крови; а также при изучении клеток культуры тканей и т.п. Интерференционная микроскопия решает те же задачи, что и фазово-контрастная.

Но если последняя позволяет наблюдать лишь контуры объектов исследования, то с помощью интерференционной микроскопии можно изучать детали прозрачного объекта и проводить их количественный анализ. Это достигается благодаря раздвоению луча света в микроскопе: один из лучей проходит через частицу наблюдаемого объекта, а другой мимо нее.

В окуляре микроскопа оба луча соединяются и интерферируют между собой. Возникающую разность фаз можно измерить, определив т. о. массу различных клеточных структур. Последовательное измерение разности фаз света с известными показателями преломления дает возможность определять толщину живых объектов и нефиксированных тканей, концентрацию в них воды и сухого вещества, содержание белков и т.д.

На основании данных интерференционной микроскопии можно косвенно судить о проницаемости мембран, активности ферментов, клеточном метаболизме объектов исследования. Поляризационная микроскопия позволяет изучать объекты исследования в свете, образованном двумя лучами, поляризованными во взаимноперпендикулярных плоскостях, т.е. в поляризованном свете.

Для этого используют пленчатые поляроиды или призмы Николя, которые помещают в микроскопе между источником света и препаратом. Поляризация меняется при прохождении (или отражении) лучей света через различные структурные компоненты клеток и тканей, свойства которых неоднородны.

В так называемых изотропных структурах скорость распространения поляризованного света не зависит от плоскости поляризации, в анизотропных структурах скорость его распространения меняется в зависимости от направления света по продольной или поперечной оси объекта.

Если показатель преломления света вдоль структуры больше, чем в поперечном направлении, возникает положительное двойное лучепреломление, при обратных взаимоотношениях — отрицательное двойное лучепреломление. Многие биологические объекты имеют строгую молекулярную ориентацию, являются анизотропными и обладают положительным двойным преломлением света.

Такими свойствами обладают миофибриллы, реснички мерцательного эпителия, нейрофибриллы, коллагеновые волокна и др. Сопоставление характера преломления лучей поляризованного света и величины анизотропии объекта позволяет судить о молекулярной организации его структуры (рис. 2).

Поляризационная микроскопия является одним из гистологических методов исследования (Гистологические методы исследования), способом микробиологической диагностики (Микробиологическая диагностика), находит применение в цитологических исследованиях (Цитологическое исследование) и др.

При этом в поляризованном свете можно исследовать как окрашенные, так и неокрашенные и нефиксированные, так называемые нативные препараты срезов тканей. Широкое распространение имеет люминесцентная микроскопия. Она основана на свойстве некоторых веществ давать свечение — люминесценцию в УФ-лучах или в сине-фиолетовой части спектра.

Многие биологические вещества, такие как простые белки, коферменты, некоторые витамины и лекарственные средства, обладают собственной (первичной) люминесценцией. Другие вещества начинают светиться только при добавлении к ним специальных красителей — флюорохромов (вторичная люминесценция).

Флюорохромы могут распределяться в клетке диффузно либо избирательно окрашивают отдельные клеточные структуры или определенные химические соединения биологического объекта. На этом основано использование люминесцентной микроскопии при цитологических и гистохимических исследованиях (см. Гистохимические методы исследования).

С помощью иммунофлюоресценции в люминесцентном микроскопе выявляют вирусные антигены и их концентрацию в клетках, идентифицируют вирусы, определяют антигены и антитела, гормоны, различные продукты метаболизма и т.д. (рис. 3).

В связи с этим люминесцентную микроскопию применяют в лабораторной диагностике таких инфекций, как герпес, эпидемический паротит, вирусный гепатит, грипп и др., используют в экспресс-диагностике респираторных вирусных инфекций, исследуя отпечатки со слизистой оболочки носа больных, и при дифференциальной диагностике различных инфекций.

В патоморфологии с помощью люминесцентной микроскопии распознают злокачественные опухоли в гистологических и цитологических препаратах, определяют участки ишемии мышцы сердца при ранних сроках инфаркта миокарда, выявляют амилоид в биоптатах тканей и т.д.

Ультрафиолетовая микроскопия основана на способности некоторых веществ, входящих в состав живых клеток, микроорганизмов или фиксированных, но не окрашенных, прозрачных в видимом свете тканей, поглощать УФ-излучение с определенной длиной волн (400—250 нм).

Этим свойством обладают высокомолекулярные соединения, такие как нуклеиновые кислоты, белки, ароматические кислоты (тирозин, триптофан, метилалании), пуриновые и пирамидиновые основания и др. С помощью ультрафиолетовой микроскопии уточняют локализацию и количество указанных веществ, а в случае исследования живых объектов — их изменения в процессе жизнедеятельности.

Инфракрасная микроскопия позволяет исследовать непрозрачные для видимого света и УФ-излучения объекты путем поглощения их структурами света с длиной волны 750—1200 нм. Для инфракрасной микроскопии не требуется предварительной химической обработки препаратов. Этот вид М.м.и. наиболее часто используют в зоологии, антропологии, других отраслях биологии.

В медицине инфракрасную микроскопию применяют в основном в нейроморфологии и офтальмологии. Для исследования объемных объектов используют стереоскопическую микроскопию. Конструкция стереоскопических микроскопов позволяет видеть объект исследования правым и левым глазом под разными углами. Исследуют непрозрачные объекты при относительно небольшом увеличении (до 120 раз).

Стереоскопическая микроскопия находит применение в микрохирургии (Микрохирургия), в патоморфологии при специальном изучении биопсийного, операционного и секционного материала, в судебно-медицинских лабораторных исследованиях. Для изучения на субклеточном и макромолекулярном уровнях структуры клеток, тканей микроорганизмов и вирусов используют электронную микроскопию. Этот М.м.и.

позволил перейти на качественно новый уровень изучения материи. Он нашел широкое применение в морфологии, микробиологии, вирусологии, биохимии, онкологии, генетике, иммунологии, Резкое повышение разрешающей способности электронного микроскопа обеспечивается потоком электронов, проходящих в вакууме через электромагнитные поля, создаваемые электромагнитными линзами. Электроны могут проходить через структуры исследуемого объекта (трансмиссионная электронная микроскопия) или отражаться отних (сканирующая электронная микроскопия), отклоняясь под разными углами, в результате чего возникает изображение на люминесцентном экране микроскопа. При трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии получают плоскостное изображение структур (рис. 4), при сканирующей — объемное (рис. 5). Сочетание электронной микроскопии с другими методами, например с радиоавтографией, гистохимическими, иммунологическими методами исследования (Иммунологические методы исследования), позволяет проводить электронно-радиоавтографические, электронно-гистохимические, электронно-иммунологические исследования. Электронная микроскопия требует специальной подготовки объектов исследования, в частности химической или физической фиксации тканей и микроорганизмов. Биопсийный материал и секционный материал после фиксации обезвоживают, заливают в эпоксидные смолы, режут стеклянными или алмазными ножами на специальных ультратомах, позволяющих получать ультратонкие срезы тканей толщиной 30—50 нм. Их контрастируют и затем изучают в электронном микроскопе. В сканирующем (растровом) электронном микроскопе изучают поверхность различных объектов, напыляя на них в вакуумной камере электронно-плотные вещества, и исследуют так называемые реплики, повторяющие контуры образца. См. также Микроскоп.

Рис. 2б). Микропрепарат миокарда в поляризованном свете при внезапной смерти от острой коронарной недостаточности — выявляются участки, в которых отсутствует характерная поперечная исчерченность кардиомиоцитов; ×400.

Рис. 2а). Микропрепарат миокарда в поляризованном свете в норме.

Рис. 3. Микропрепарат перитонеального макрофага в клеточной культуре, люминесцентная микроскопия.

Рис. 4. Электронограмма кардиомиоцита, полученная при трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии: отчетливо видны субклеточные структуры; ×22000.

Рис. 1. Микропрепарат миокарда при внезапной смерти от острой коронарной недостаточности: окраска по Ли позволяет выявить контрактурные пересокращения миофибрилл (участки красного цвета); ×250.

им бактерии, полученная при сканирующей электронной микроскопии; ×20000″>

Рис. 5. Электронограмма лейкоцита и фагоцитируемой им бактерии, полученная при сканирующей электронной микроскопии; ×20000.

Источник: //dic.academic.ru/dic.nsf/enc_medicine/18839/%D0%9C%D0%B8%D0%BA%D1%80%D0%BE%D1%81%D0%BA%D0%BE%D0%BF%D0%B8%D1%87%D0%B5%D1%81%D0%BA%D0%B8%D0%B5

Микроскопический метод

Микроскопические методы исследования
Микроскопические исследования проводят с помощью микроскопа, который позволяет изучать невидимые глазом объекты. Этот метод используют для исследования клеточного состава биологических жидкостей пациента (крови, мочи, спермы, ликвора, желчи), кала, а также соскобов и срезов тканей, применим он и в микробиологии для исследования микроорганизмов и паразитов.

История изобретения микроскопа связана с развитием оптики. Способность прозрачных предметов с изогнутыми поверхностями (линз) изменять размеры изображения была известна человечеству давно (приблизительно еще за 300 лет до н. э). Именно эти свойства и привели к изобретению луп и очков. В 1595 г. голландец 3.

Янсен изобрел первый оптический прибор, который представлял собой полую трубку с двумя линзами и увеличивал изображение в 3-10 раз. В 1609 г. итальянец Г. Галилей усовершенствовал этот прибор: сделал возможным изменять расстояние между линзами и таким образом добиваться более четкого изображения.Слово «микроскоп» появилось в 1625 г. благодаря итальянцу И.

Фаберу и уже в 1665 г. прибор, который им обозначается позволил англичанину Р. Гуку сделать научное открытие – впервые была описана растительная клетка. В конце XVII в. голландец А. Левенгук увидел с помощью микроскопа микроорганизмы в капле воды.По мере изучения свойств света и развития оптической техники, микроскопы совершенствовались.

Это позволяло детально изучать строение тканей живых макро- (в том числе человека) и микроорганизмов (бактерий, простейших, вирусов, грибков и др.). Бурное развитие микроскопии началось в конце XIX в.Создание в 1926 г. немецким физиком X. Бушем линзы с магнитными свойствами привело в дальнейшем к изобретению электронного микроскопа в 40-х гг. XX в.

Главной характеристикой микроскопа является разрешающая способность. Чем она больше, тем лучше качество получаемого изображения. Человек способен различить точки, расстояние между которыми не менее 0,08 мм, следовательно, объекты менее 0,08 мм человеческий глаз вообще не замечает.

Световой микроскоп позволяет увидеть мелкие объекты, расстояние между которыми колеблется от 0,08 мм до 0,2 мкм, а с помощью электронного микроскопа можно рассмотреть объекты, размеры которых составляют 0,1-0,01 нм.

Классический микроскоп представляет собой штатив с подвижным тубусодержателем, осветителем и предметным столиком. Прикрепленный к ним тубус (полая трубка) оснащен системой линз. К предметному столику снизу прикреплено зеркало.

Изменяя положение осветителя, зеркала и рабочей поверхности предметного столика с помощью специальных вентилей, можно добиться точной фокусировки световых лучей на исследуемом объекте и появления отчетливого изображения в объективе.

На нижнем конце тубуса имеются 2-3 подвижных объектива с разной степенью увеличения, на верхнем конце – окуляр. Исследование начинают с использования объектива с меньшим увеличением и более широким полем зрения. Затем при необходимости приступают к более детальному изучению материала от больного.

Для проведения световой микроскопии биологический материал предварительно фиксируют на предметном стекле и окрашивают.

Во время фиксации происходит разрушение некоторых внутренних структур клеток, причем окрашиванию подвергаются только убитые клетки, поскольку в живых краска скапливается в вакуолях и другие клеточные структуры остаются незаметными.

Использование дополнительных приспособлений (темнопольного конденсора) позволяет изучать и неизмененные (живые) клетки.В зависимости от исследуемого материала меняют направление освещения, чтобы получить изображение в окуляре.

Метод светлого поля в проходящем свете. Используют для микроскопии прозрачных и неоднородных по структуре объектов. Освещение направлено на исследуемый объект снизу, световые лучи проходят сквозь прозрачную среду и поглощаются в местах большей плотности. Чтобы изображение было более контрастным, материал для исследования предварительно окрашивают.

Метод косого освещения. Используют для исследования прозрачных объектов. Сам метод подразумевает исследование объекта в свете, падающем под большим углом. При этом можно выявить особенности поверхности объекта (рельефность, контуры).
Метод темного поля. Освещение направлено на исследуемый прозрачный объект таким образом, что проходящие через него лучи собираются вместе и не попадают в объектив, благодаря чему получается светлое изображение на темном фоне.Световая микроскопия подразделяется на фазовоконтрастную, интерференционную, поляризационную, люминесцентную, инфракрасную, стереоскопическую и основана на использовании различных свойств света и изучаемого объекта (прозрачный или непрозрачный). Свойства исследуемого объекта (материала от пациента) влияют на направленность и характеристики отраженного света: длина световой волны и амплитуда ее колебания, направление. В результате исследуемый объект приобретает определенные яркость и цвет.

Фазово-контрастная микроскопия

С помощью фазово-контрастной микроскопии исследуют живые и не подвергшиеся окрашиванию биологические материалы (срезы тканей живого организма). Этот способ основан на свойствах луча отклоняться от исследуемого материала под разным углом в зависимости от его свойств. При этом происходит изменение длины световой волны и ее фазы.

Если микроскопии подвергаются живые или фиксированные, но не окрашенные объекты, т. е. прозрачные, то цвет светового луча при отражении почти не изменяется, а угол отклонения изменяется. При отражении света меняются и его свойства.

Если разность между длиной волны направленного на исследуемый объект и отраженного света составляет одну четверть или более, то исследуемый объект видится темным на светлом фоне.

Вариантом фазово-контрастного микроскопического исследования является амплитудно-контрастное (аноптральное) исследование, проводимое с применением специального объектива, позволяющего изменять только яркость и цвет направленного на изучаемый объект света (фона). Таким образом, можно определить контуры клеток, их размеры и число.

Интерференционная микроскопия

Интерференционную микроскопию также используют для исследования живых и неокрашенных объектов. Этот способ позволяет изучать внутреннее строение клеток и основывается на раздвоении светового луча в микроскопе при прохождении через клетку с включенными в нее структурами (ядрами, вакуолями и др.).

В окуляре микроскопа световые лучи соединяются, образуя свет с другими свойствами (изменяется амплитуда колебания световой волны).

Большинство клеток организма человека имеют размеры 30-50 мкм.

Самые крупные клетки – это яйцеклетки (150 мкм), а самые маленькие – сперматозоиды (3-5 мкм) и эритроциты (в среднем 7,5 мкм).
С помощью определения длины волны полученного света можно установить наличие определенных структур в клетке.

Так, последовательно устанавливая изменения свойств света, можно узнать толщину клетки, содержание в ней воды и сухого остатка, белков. Это исследование позволяет определить проницаемость мембраны и изменение веществ в клетке.

Поляризационная микроскопияПри поляризационной микроскопии объект исследуют в перпендикулярно направленных световых лучах, т.е. в поляризованном свете. При прохождении через неоднородные клеточные структуры и отражении свойства поляризованного света становятся иными. Изменяются его направление (вдоль поперечной или продольной оси исследуемого объекта) и скорость распространения. В зависимости от этих характеристик можно определить наличие тех или иных структур в клетке. Исследованию подвергаются и окрашенные, и неокрашенные материалы от пациента.Поляризационная микроскопия необходима для изучения строения тканей, выявления патологических изменений и болезнетворных микроорганизмов в клетках.

Люминисцентная микроскопия

Люминисцентный способ микроскопии позволяет выявить свечение некоторых объектов в ультрафиолетовых лучах и определить наличие в исследуемом материале белков, ферментов, определенных витаминов и лекарственных веществ. Некоторые вещества начинают светиться в ультрафиолетовых лучах при добавлении красителей (флюорохромов).

При этом красящее вещество может равномерно распределяться по клетке или концентрироваться только в определенных структурах.С помощью этого исследования можно изучить не только структуру клетки, но и частично ее химический состав. Исследуя срезы тканей таким образом, можно определить, например, амилоидоз, инфаркт, опухоли.

Люминисцентные микроскопические исследования используют и в иммунологии.

Инфракрасная микроскопия

Инфракрасная микроскопия основана на способности непрозрачных в видимом и ультрафиолетовом свете объектов поглощать свет с длиной волны 750-1200 нм, при этом химической подготовки исследуемый материал не требует. Инфракрасную микроскопию используют для исследования нервной ткани и в офтальмологии.

Стереоскопическая микроскопия

Стереоскопические исследования проводят с помощью специальных микроскопов, которые позволяют видеть объект под разными углами, с небольшим увеличением размеров исследуемого непрозрачного объекта.

Этот метод нашел свое применение в исследованиях тканей, взятых у больного при биопсии, операции, и особенно широко используется в судебной медицине.

Исследование внутриклеточных структур тканей человеческого организма и микроорганизмов проводят с помощью электронного микроскопа, который обладает высокой способностью увеличивать исследуемые объекты. Вместо светового луча на них направляют поток электронов, который поглощается с образованием электромагнитного поля или отражается. В результате на экране можно увидеть изображение исследуемого объекта, при этом в первом случае получается плоское изображение, во втором – объемное. В ходе исследования определяют форму, размер объекта и его поверхность.Материал для исследования предварительно подвергают химической обработке: обезвоживают и заливают смолами. Затем делают очень тонкие срезы тканей, полученных с помощью стеклянных или алмазных ножей. Срезы фиксируют на предметном стекле и окрашивают.

Источник: //analizy.vse-zabolevaniya.ru/mikroskopicheskij-metod/

Тема 3 Микроскопические методы исследования

Микроскопические методы исследования

вмикробиологии: устройство микроскопаи основные приемы микроскопированияживых микроорганизмов

1 Особенностиразных видов микроскопии

2 Устройствосветлопольного микроскопа

3 Правила работыс иммерсионным объективом

4 Приемымикроскопирования живых микроорганизмов

1 Особенности разных видов микроскопии

Основными задачамимикроскопии являются следующие:

  • Выявление микроорганизмов в различных материалах.

  • Ориентировочная идентификация микроорганизмов в образце.

  • Изучение некоторых морфологических признаков и структур микроорганизмов (например, капсул, жгутиков и т. д.).

  • Изучение окрашенных мазков из колоний и чистых культур.

На сегодняшнийдень наиболее используемой являетсясветовая микроскопия.

Световаямикроскопияобеспечивает увеличение до 2–3 тысячраз, цветное и подвижное изображениеживого объекта, возможность микрокиносъемкии длительного наблюдения одного и тогоже объекта, оценку его динамики и химизма.

Изображениев световом микроскопе формируетсявследствие того, что объект и различныеего структуры избирательно поглощаютсвет с различной длиной волны (абсорбционныйконтраст) или вследствие изменения фазысветовой волны при прохождении светачерез объект (фазовый контраст).

Основнымихарактеристиками любого микроскопаявляются разрешающая способность иконтраст. Разрешающаяспособность– это минимальное расстояние, на которомнаходятся две точки, демонстрируемыемикроскопом раздельно. Разрешениечеловеческого глаза в режиме наилучшеговидения равно 0,2 мм.

Контрастизображения –это различие яркостей изображения ифона. Если это различие составляет менее3–4 %, то его невозможно уловить ни глазом,ни фотопластинкой; тогда изображениеостанется невидимым, даже если микроскопразрешает его детали.

На контраст влияюткак свойства объекта, изменяющие световойпоток по сравнению с фоном, так испособности оптики уловить возникающиеразличия в свойствах луча. Возможностисветового микроскопа ограничены волновойприродой света.

Физические свойствасвета – цвет (длина волны), яркость(амплитуда волны), фаза, плотность инаправление распространения волныизменяются в зависимости от свойствобъекта. Эти различия и используются всовременных микроскопах для созданияконтраста.

Увеличениемикроскопаопределяется как произведение увеличенияобъектива на увеличение окуляра. Утипичных исследовательских микроскоповувеличение окуляра равно 10, а увеличениеобъективов – 10, 40 и 100.

Соответственно,увеличение такого микроскопа составляетот 100 до 1 000. Некоторые из микроскоповимеют увеличение до 2 000. Еще более высокоеувеличение не имеет смысла, так как приэтом разрешающая способность неулучшается.

Напротив, качествоизображения ухудшается.

Числовая апертураиспользуется для выражения разрешающейспособности оптической системы. Числоваяапертура – это оптический «охват»линзы, она является мерой количествасвета, попадающего в линзу. Числоваяапертура объектива указана на егооправе. Апертура конденсора должнасоответствовать числовой апертуреобъектива.

Числовая апертура любойлинзы, граничащей с воздухом (т.е. «сухойсистемы»), не может превысить 1, так какпоказатель преломления воздуха равен1. Числовую апертуру можно повысить,если увеличить показатель преломлениясреды между фронтальной линзой объективаи предметным стеклом, приблизив его кпоказателю преломления стекла (1,5).

Дляэтого между фронтальной линзой объективаи исследуемым объектом помещают каплюжидкости с показателем преломлениябольшим, чем показатель преломлениявоздуха, например, каплю воды (n= 1,3), глицерина (n= 1,4) или кедрового (иммерсионного) масла(n= 1,5).

Для каждой из указанных вышежидкостей выпускаются специальныеобъективы, которые называютсяиммерсионными.

Световаямикроскопия включаетобычную просвечивающуюмикроскопию (светло-, темнопольную),фазово-контрастную, люминесцентную. Впоследнее время разработаны и другиеспособы микроскопии и микроскопы –инверсионнаяиконфокальная лазерная сканирующаямикроскопия.

Светлопольнаямикроскопияпозволяет исследовать объекты впроходящем свете в светлом поле.

Данныйвид микроскопии предназначен дляисследования морфологии, размеровклеток, их взаимного расположения,структурной организации клеток и другихособенностей.

У светового микроскопамаксимальная разрешающая способностьсоставляет 0,2 мкм, что обеспечиваетвысокоточное увеличение микроскопа до1500х.

Фазово-контрастнаямикроскопияпозволяет более четко наблюдать живыепрозрачные объекты, которые имеюткоэффициенты преломления, близкие ккоэффициентам преломления среды.

Действие фазово-контрастного микроскопаосновано на интерференции света вплоскости изображения, обусловленнойсдвигом по фазе (при использованиифазового кольца в апертурной диафрагме).

При фазово-контрастной микроскопиичасто применяют биологические микроскопыс обратным расположением оптики –инвертированные микроскопы. У такихмикроскопов объективы расположеныснизу, а конденсор – сверху.

С помощьюфазово-контрастной микроскопии изучаютформу, размеры, взаимное расположениеклеток, их подвижность, размножение,прорастание спор микроорганизмов и т.д. Благодаряприменению этого способа микроскопииконтраст живых неокрашенных микроорганизмоврезко увеличивается и они выглядяттемными на светлом фоне (позитивныйфазовый контраст) или светлыми на темномфоне (негативный фазовый контраст).

Темнопольнаямикроскопияоснована на освещении объекта косымилучами света. При таком освещении лучине попадают в объектив, поэтому полезрения выглядит темным.

Такое освещениепрепарата достигается использованиемспециального темнопольного конденсора.Темнопольная микроскопия являетсяочень простым, но эффективным методоми хорошо подходит для полученияизображения живых и неокрашенныхбиологических образцов.

Учитываяпростоту установки, качество получаемыхизображений весьма хорошее.

При микроскопированиив темном поле можно увидеть объекты,величина которых измеряется сотымидолями микрометра, что находится запределами разрешающей способностиобычного светлопольного микроскопа.Однако наблюдение за объектами в темномполе позволяет исследовать толькоконтуры клеток и не дает возможностирассмотреть их внутреннюю структуру.

Люминесцентная(флуоресцентная) микроскопияоснована на способности ряда веществбиологического происхождения илинекоторых красителей светиться при ихосвещении невидимым ультрафиолетовымили синим светом. При использованииультрафиолетового света разрешающаяспособность микроскопа может достигать0,1 мкм.

Клеткимикроорганизмов обрабатывают специальнымикрасителями – флуорохромами (акридиновыйоранжевый, примулин, родамин и др.) ввиде сильно разбавленных водныхрастворов: 1:500–1:100 000. Такие растворыслабо токсичны, что дает возможностьизучать неповрежденную клетку.

Взависимости от химического состава,клеточные структуры в разной степениадсорбируют красители и люминесцируютразличным образом. Кроме того, флуорохромынеодинаково адсорбируются живыми имертвыми клетками.

Это позволяетиспользовать данный вид микроскопиидля цитологических и иммунологическихисследований, определения жизнеспособностиклеток и т. д.

Электроннаямикроскопияпозволяет обнаружить объекты, которыене разрешаются при использованиисветовых или ультрафиолетовых лучей.Теоретическиразрешениепросвечивающегоэлектронного микроскопасоставляет 0,002 нм; реальное разрешениесовременных электронныхмикроскоповприближается к 0,1 нм. На практикеразрешение для биологических объектовдостигает 2 нм.

Короткая длинаволны электронов позволяет различитьобъекты размером 0,5–1,0 нм. В современныхэлектронных микроскопах на экранедостигается увеличение 5000– 200 000.Благодаря столь высокому разрешениюстановится возможным выявление деталейбактериальных структур.

Например, спомощью напыления солей тяжелых металлов,окружающих бактерию и проникающих вповерхностные неровности, получаютконтрастирование за счет дифференциальнойзадержки электронов. Этот эффект получилназвание негативногоконтрастирования.

Электронныймикроскоп, в котором изображениеформируется благодаря прохождению(просвечиванию) электронов через образец,называют просвечивающим(или трансмиссионным).

В сканирующемэлектронном микроскопе (растроваяэлектронная микроскопия (РЭМ)пучок электронов быстро сканируетповерхность образца, вызывая излучение,которое формирует изображение насветящемся экране.

Для РЭМ характернывысокаяразрешающая способность, большойдиапазон увеличений (до 100 000 и выше),большая глубина фокусировки (~100 мкм),многообразие режимов работы.

Сканирующиймикроскоп дает картину поверхностей ипозволяет получать трехмерное изображение.

Лазернаяконфокальная микроскопиядает возможность получить отчетливоеизображение и наблюдать объекты в фокусепо всему полю. Данныйметод пригоден лишь для исследованиясамосветящихся (флуоресцентных) объектов.При сочетаниис компъютерной техникой возможнапространственная реконструкцияизучаемого объекта.

В конфокальном лазерном сканирующеммикроскопе изображения внутреннихсечений формируются за счет сканированиясфокусированным лазерным пучком отразных (405, 488, 532, 635 нм) лазеров ипространственной фильтрации излучения.При использовании сканирующей микроскопииближнего поля (СМБП) достигается высокаяразрешающая способность.

Наименьшийразмер элемента, полученного с помощьюСМБП, составляет 20 нм при длине волнысвета 0,486 нм. В изображении контролируемогоэлемента отсутствуют дифракционныеили интерференционные эффекты,затрудняющие определение его границ.

Отличительной особенностью СМБП посравнению с атомно-силовым микроскопомявляется чувствительность к оптическимхарактеристикам поверхности контролируемогообразца, длине волны света, люминесценциии др.

Компьютернаяинтерференционная микроскопияпозволяет получить высококонтрастноеизображение при наблюдении субклеточныхструктур; во многих случаях применяетсядля изучения живых клеток.

Принципдействия автоматизированногоинтерференционного микроскопа основанна интерференции световых пучковлазерного излучения, отраженного отопорного зеркала и зеркала, на которомпомещен измеряемый фазовый объект.

Теоретически предельнодостижимая разрешающая способностьможет составить в среднем 0,2 нм, практическиона составляет 0,4 мкм.

Рентгеновскаякомпьютерная томография (РКТ), позитроннаяэмиссионная томография(ПЭТ)позволяют наблюдать объекты в обычныхусловиях.

Источник: //studfile.net/preview/5244850/page:8/

Ваш Недуг
Добавить комментарий