Иммунофлюоресценция

5. Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компонен­ты, применение

Иммунофлюоресценция

Иммунофлюоресцентныйметод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции,реакция Кунса) -метод выявления специфических АГ спомощью АТ, конъюгированных с флюорохромом.Обладает высокой чувствительностью испецифичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционныхзаболеваний (идентификация возбудителяв исследуемом материале), а также дляопределения АТ и поверхностных рецепторови маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование)и др. клеток.

Обнаружениебактериальных и вирусных антигенов винфек­ционных материалах, тканяхживотных и культурах клеток при помощифлюоресцирующих антител (сывороток)получило широкое применение вдиагностической практике.

Приготовлениефлюоресцирующих сывороток основано наспо­собности некоторых флюорохромов(например, изотиоцианата флюоресцеина)вступать в химическую связь с сывороточнымибелками,  не нарушая их иммунологическойспецифичности.

Различают триразновидности метода: прямой, непрямой,с комплементом. Прямойметод РИФ основанна том, что антигены тканей или микробы,обработанные иммунными сыворотками сантителами, меченными флюорохромами,способны светиться в УФ-лучах люминесцентногомикроскопа.

Бактерии в мазке, обработанныетакой люминесцирующей сывороткой,светятся по периферии клетки в видекаймы зеленого цвета. Непрямойметод РИФ заключаетсяв выявлении комплекса антиген – антителос помощью антиглобулиновой (противантитела) сыворотки, меченной флюорохромом.

Для этого мазки из взвеси микробовобрабатывают антителами антимикробнойкроличьей диагностической сыворотки.Затем антитела, не связавшиеся антигенамимикробов, отмывают, а оставшиеся намикробах антитела выявляют, обрабатываямазок антиглобулиновой (антикроличьей)сывороткой, меченной флюорохромами.

Врезультате образуется комплекс микроб+ антимикробные кроличьи антитела +антикроличьи антитела, меченныефлюорохромом. Этот комплекс наблюдаютв люминесцентном микроскопе, как и припрямом методе.

Механизм.На предметном стекле готовят мазок изисследуемого ма­териала, фиксируютна пламени и обрабатывают иммуннойкроличьей сывороткой, содержащейантитела против антигенов возбудителя.

Для образования комплекса антиген —антитело препарат помещают во влажнуюкамеру и инкубируют при 37 °С в течение15 мин, после чего тщательно промываютизотоническим раствором хлорида натриядля удаления не связавших­ся с антигеномантител.

Затем на препарат наносятфлюоресци­рующую антиглобулиновуюсыворотку против глобулинов кро­лика,выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, азатем препарат тщательно промываютизотоническим раствором хлорида натрия.

В результате связывания флюоресцирующейантиглобулиновой сыворотки с фиксированнымина антигене специфическимиантителами  образуются  светящиеся   комплексы   антиген— антитело,которые   обнаруживаются   при   люминесцентной   микроскопии.

7. Анафилактический шок и сывороточная болезнь. Причи­ны возникновения. Механизм. Их предупреждение

Анафилаксия пред­ставляетсобой реакцию немедленного типа,возникающую при парентеральном повторномвведении антигена в ответ на повреждающеедействие комплекса антиген — антителои характеризу­ющуюся стереотипнопротекающей клинической и морфологи­ческойкартиной.

Основную роль ванафилаксии играет цитотропный IgE,име­ющий сродство к клеткам, в частностибазофилам и тучным клеткам. После первогоконтакта организма с антигеномобра­зуется IgE,который вследствие цитотропностиадсорбируется на поверхности названныхвыше клеток.

При повторном попадании ворганизм этого же антигена IgE связываетантиген с образо­ванием на мембранеклеток комплекса IgE —антиген. Комплекс повреждает клетки,которые в ответ на это выделяют медиато­ры— гистамин и гистаминоподобные вещества(серотонин, кинин).

Эти медиаторысвязываются рецепторами, имеющимисяна поверхности функциональных мышечных,секреторных, сли­зистых и другихклеток, вызывая их соответствующиереакции.

Это ведет к сокращению гладкоймускулатуры бронхов, кишеч­ника,мочевого пузыря, повышению проницаемостисосудов и другим, функциональным иморфологическим изменениям, ко­торыесопровождаются клиническим проявлением.

Клинически анафилаксия проявляется ввиде одышки, удушья, слабости, беспокойства,судорог, непроизвольного мочеиспускания,дефе­кации и др. Анафилактическаяреакция протекает в три фазы: в 1-й фазепроисходит сама реакция антиген —антитело; во 2-й фазе выделяются медиаторыанафилактической реакции; в 3-й фазепроявляются функциональные изменения.

Анафилактическаяреакция возникаетспустя несколько ми­нут или часовпосле повторного введения антигена.Протекает в виде анафилактическогошока или как местные проявления.Интенсивность реакции зависит от дозыантигена, количества об­разующихсяантител, вида животного и может закончитьсявыз­доровлением или смертью.

Анафилаксиюлегко можно вызвать в эксперименте наживотных. Оптимальной моделью длявоспро­изведения анафилаксии являетсяморская свинка. Анафилаксия можетвозникать на введение любого антигеналюбым способом (подкожно, через дыхательныепути, пищеварительный тракт) при условии,что антиген вызывает образованиеиммуноглобу­линов.

Доза антигена,вызывающая сенсибилизацию, т. е. повышеннуючувствительность, называетсясенсибилизирующей. Она обычно оченьмала, так как большие дозы могут вызватьне сенсибилизацию, а развитие иммуннойзащиты. Доза антигена, введенная ужесенсибилизированному к нему животномуи вы­зывающая проявление анафилаксии,называется разрешающей.

Разрешающаядоза должна быть значительно больше,чем сен­сибилизирующая.

Состояниесенсибилизации после встречи сантигеном сохра­няетсямесяцами, иногда годами; интенсивностьсенсибилизации можно искусственноуменьшить введением малых разрешающихдоз антигена, которые связывают и выводятиз циркуляции в организме часть антител.

Этот принцип был использован дляде­сенсибилизации (гипосенсибилизации),т.е. предупреждения анафилактическогошока при повторных введениях антигена.Впер­вые способ десенсибилизациипредложил русский ученый А. Без­редка(1907), поэтому он называется способомБезредки.

Спо­соб состоит в том, чточеловеку, ранее получавшему какой-либоантигенный препарат (вакцину, сыворотку,антибиотики, пре­параты крови и др.),при повторном введении (при наличии унего повышенной чувствительности кпрепарату) вначале вво­дят небольшуюдозу (0,01; 0,1 мл), а затем, через 1—1'/2 ч,— основную.

Таким приемом пользуютсяво всех клиниках для избежания развитияанафилактического шока; этот приемявляет­ся обязательным.

Возможен пассивныйперенос анафилаксии с антителами.

Сывороточнойболезнью называютреакцию, возникающую при разовомпарентеральном введении больших дозсывороточных и других белковых препаратов.Обычно реакция возникает спустя 10—15сут.

Механизм сывороточной болезнисвязан с образова­нием антител противвведенного чужеродного белка (антигена)и повреждающим действием на клеткикомплексов антиген — антитело.

Клиническисывороточная болезнь проявляется отекомкожи и слизистых оболочек, повышениемтемпературы тела, припуханием суставов,сыпью и зудом кожи; наблюдаются измене­нияв крови (увеличение СОЭ, лейкоцитоз идр.).

Сроки про­явления и тяжестьсывороточной болезни зависят отсодержа­ния циркулирующих антител идозы препарата. Это объясняется тем,что ко 2-й неделе после введения белковсыворотки выра­батываются антителак белкам сыворотки и образуется комплексантиген — антитело. Профилактикасывороточной болезни осу­ществляетсяпо способу Безредки.

Источник: //studfile.net/preview/3992524/page:3/

Метод Иммунофлюоресценции – Медицинский Центр Био-Лайн

Иммунофлюоресценция

Это определение наличия антител класса IgM к следующим инфекциям:

  1. RSV (pеспираторно-синцитиальный вирус).
  2. Adenovirus type 3
  3. Influenza virus type A (H1N1)
  4. Influenza virus type A (H3N2)
  5. Influenza virus type B
  6. Parainfluenza virus type 1
  7. Parainfluenza virus type 2
  8. Parainfluenza virus type 3
  9. Parainfluenza virus type 4
  10. Bordetella pertussis
  11. Bordetella parapertussis
  12. Mycoplasma pneumoniae
  13. Coxsackie virus тип B1
  14. Coxsackie virus тип A7
  15. Echo virus тип 7
  16. Chlamydia pneumoniae
  17. Haemophilus influenzae
  18. Klebsiella pneumoniae
  19. Legionella pneumophila серотип 16
  20. Legionella pneumophila серотип 126

Результат: качественно, отдельно по каждой позиции в формате: «Отрицательный» или «Положительный».

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: терапевты, инфекционисты, пульмонологи и др.

Мозаика «Центральная нервная система», (IgG), иммунофлюоресценция (РНИФ)

Это определение наличия антител класса IgG к следующим инфекциям:

  1. Rubella virus
  2. Measles
  3. Mumps
  4. Varicella zoster virus
  5. Adenovirus type 3
  6. EBV, капсидный антиген
  7. Treponema pallidum
  8. Toxoplasma gondii
  9.  HSV type 1
  10.  HSV type 2
  11. Coxsackie virus type B1
  12. Coxsackie virus type A7
  13. Echovirus тип 7
  14. Borrelia afzelii
  15. Borrelia burgdorferi sensu stricto
  16. Borrelia garinii
  17. CMV
  18. Haemophilus influenzae
  19. Listeria monocytogenes 1/2а
  20. Listeria monocytogenes 4b

Результат: качественно, отдельно по каждой позиции в формате: «Отрицательный» или «Положительный».

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Примечание: Лабораторное заключение содержит рекомендации по дальнейшей тактике проведения лабораторных исследований для уточнения положительного результата в количественном/полуколичественном формате.

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: невропатологи, инфекционисты и др.

Мозаика «Инфекционный артрит», (IgG), иммунофлюоресценция (РНИФ)

Это определение наличия антител класса IgGк следующим инфекциям:

  1. Varicella zoster virus
  2. Influenza virus type A (H1N1)
  3. Influenza virus type A (H3N2)
  4. Influenza virus type B
  5. Yersinia enterocolitica O:3
  6. Yersinia enterocolitica O:6
  7. Yersinia enterocolitica O:9
  8. Toxoplasma gondii
  9. Borrelia afzelii
  10. Borrelia burgdorferi sensu stricto
  11. Borrelia garinii
  12. Chlamydia trachomatis

Результат: качественно, отдельно по каждой позиции в формате: «Отрицательный» или «Положительный».

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Примечание: Лабораторное заключение содержит рекомендации по дальнейшей тактике проведения лабораторных исследований для уточнения положительного результата в количественном/полуколичественном формате.

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: ревматологи, инфекционисты, терапевты и др.

Антитела (IgG) к вирусу Varicella Zoster (VZV), иммунофлюоресценция

Это определение наличия антител класса IgG к вирусу Varicella Zoster (VZV).

Результат: качественно, в формате: «Отрицательный» или «Положительный».

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: инфекционисты, невропатологи, терапевты и др.

Mозаика TORCH, (IgG), иммунофлюоресценция (РНИФ)

Это определение наличия антител класса IgGк следующим TORCH–инфекциям:

  1. Toxoplasma gondii
  2. Rubella virus
  3. HSV type1/2
  4. CMV

Результат: качественно, отдельно по каждой позиции в формате: «Отрицательный» или «Положительный».

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Примечание: Лабораторное заключение содержит рекомендации по дальнейшей тактике проведения лабораторных исследований для уточнения положительного результата в количественном/полуколичественном формате.

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: инфекционисты, гинекологи и др.

IgGк Treponemapallidum (РИФ)

Это определение наличия антител класса IgG к Treponema pallidum (РИФ).

Результатполуколичественно: отрицательный/слабоположительный (2+)/ положительный (3+ или 4+)

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: инфекционисты, дерматологи, венерологии др.

IgМ к Treponemapallidum (РИФ)

Это определение наличия антител класса IgМ к Treponema pallidum (РИФ).

Результат полуколичественно: отрицательный/ слабоположительный (2+)/ положительный (3+ или 4+)

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: инфекционисты, дерматологи, венерологи и др.

Скрининг – ANA (антинуклеарные антитела), иммунофлюоресценция (РНИФ)

Это определение наличия антител к ядерным компонентам клетки (диагностика системной красной волчанки, с-ма Шёгрена, поли/дерматомиозита, склеродермии и др.).

Результат: качественно.

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Примечание: Лабораторное заключение содержит рекомендации по дальнейшей тактике проведения лабораторных исследований для уточнения положительного результата в количественном/полуколичественном формате.

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: терапевты, ревматологи, нефрологи и др.

Скрининг – ANCA (Антинейтрофильные цитоплазматические антитела), иммунофлюоресценция (РНИФ)

Это определение наличия антител к цитоплазматическим антигенам (диагностика васкулитов (гранулематоз Вегенера, микроскопический полиангиит, синдром Черджа-Страусс, «pauci-immune» некротизирующий гломерулонефрит, узелковый полиартериит), неспецифического язвенного колита.

Результат: качественно.

Исследуемый материал: кровь (сыворотка).

Примечание: Лабораторное заключение содержит рекомендации по дальнейшей тактике проведения лабораторных исследований для уточнения положительного результата в количественном/полуколичественном формате.

Специалисты, которых может заинтересовать исследование: терапевты, ревматологи, нефрологи, гастроэнтерологи, отоларингологи и др.

Источник: //bio-line.org/metod-immunoflyuoresczenczii/

Иммунофлюоресцентный анализ

Иммунофлюоресценция

Известны прямой и непрямой методы иммунофлюоресцентного анализа. В прямом методе искомый антигенный субстрат отыскивают в ткани посредством соответствующей АС.

Сам антиген может быть антителом; в таком случае конъюгат будет представлять собой меченое анти-антитело. Непрямой метод применяется при определении антител (антигенов) в жидкостях или в том случае, когда, как упоминалось выше, нет подходящей меченой антисыворотки.

Специальной формой непрямого метода является фиксация комплемента антителами. Чувствительность метода, возможность ошибок и количество необходимых контрольных операций возрастают параллельно усложнению процедуры иммунофлюоресцентного анализа.

В ходе анализа реакция антиген-антитело протекает непосредственно на субстрате, все непрореагировавшие компоненты удаляют смыванием.

Материалы и оборудование

Для работы необходимы ФСБ с рН 7,2; лепиналовый буфер с рН 7,2; 0,575 г лепинала, 0,185 г лепинал-натрия, 0,028 г СаС1, 0,168 г MgCl2-6H20, 8,5 г NaCl, дистиллированная вода до 1000 мл.

Среда для заключения ткани: глицерин на лепиналовом буфере с рН 8,6 (10,3 г лепинал-натрия, 6,2 г NaCl, дистиллированная вода до 1000 мл). Подводят рН до 8,6 HCI и смешивают с глицерином в соотношении 1 + 3.

Также нужны пипетки с поршнем, инкубационная камера, кюветы для окрашивания, устройство для встряхивания.

Методика

Растворы при помощи поршневых пипеток осторожно наносят на препараты, следя за тем, чтобы они были полностью покрыты жидкостью. Инкубацию проводят при комнатной температуре во влажной камере в течение 30 минут.

После инкубации растворы отсасывают очень осторожно, чтобы не сдвинуть с места соседние препараты. Отмывают препараты фосфатно-солевым буфером в кюветах, на аппарате для встряхивания.

Буфер меняют с различной частотой в зависимости от цели исследования (см. ниже).

Прямой метод иммунофлюоресцентного анализа

— Препарат отмывают ФСБ в течение 10 минут (однократная смена буфера), высушивают.— Инкубируют препарат с различными разведениями коньюгата.— Препарат промывают ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).

— Препарат высушивают и заключают в подходящий материал.

Непрямой метод иммунофлюоресцентного анализа

— Препарат инкубируют с исследуемым раствором.— Отмывают ФСБ в течение 20 минут (двукратная смена буфера).— Инкубируют с различными разведениями конъюгата.— Отмывают в ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).

— Препарат высушивают, заключают в подходящий материал.

Определение комплементсвязывающих антител

После первой инкубации с инактивированной сывороткой (30 мин, 56°С), последующей отмывки, как при прямом иммунофлюоресцентном анализе, и высушивания проводят следующие манипуляции:

— Инкубация со свежей человеческой сывороткой (разведение 1+9) в качестве источника комплемента.— Отмывка в ФСБ в течение 20 минут (двухкратная смена буфера) .— Инкубация с антителами к комплементу человека (СЗ), мечененными ФИТЦ.— Отмывка в ФСБ в течение 30 минут (троекратная смена буфера).

— Высушивание и заключение в подходящую ткань.

Комплемент рекомендуется разливать на небольшие порции и хранить в жидком азоте. Нужную порцию комплемента размораживают перед употреблением и разводят лепиналовым буфером с рН 7,2.

Применение двойной флюоресцентной метки

Для одновременного анализа различных антигенов в одной и той же ткани, например в клетках одного типа, применяют антисыворотки, меченные различными флюорохромами (ФИТЦ,ТРИТЦ). Такая маркировка применяется при диагностике лимфом и точного анализа антигенов, вызывающих образование аутоантител.

Окрашивание дополнительным цветом

Окрашивание дополнительным цветом применяется для облегчения ориентации в полях зрения, облегчения установки нужных деталей, повышения контрастности. Усиления контрастности можно достичь за счет подавления фоновой флюоресценции синим Эванса (0,1 г/л, 30—60 с, последующая отмывка ФСБ дважды по 5 минут).

Для облегчения установки нужных деталей, особенно в случае объектов с незначительной нежелательной флюоресценцией, можно воспользоваться дополнительным окрашиванием альбумином, меченным родамином или бромистым этидием (10 мг/л, 2 мин). Ядра нежизнеспособных клеток приобретают оранжево-красную окраску.

Контроль качества анализа

В иммунофлюоресцентном анализе используют различные виды контроля для предотвращения ошибок и правильной оценки данных.

Контроль собственной флюоресценции объекта: проверяют объект без специальной обработки, например только после промывания.

Контроль конъюгата: объект инкубируют только с конъюгатом. Этот вид контроля применяется в непрямом методе анализа. Контроль позволяет установить наличие собственной флюоресценции препарата, а также наличие нежелательных реакций конъюгата с объектом.

Отрицательный контроль: в прямом методе анализа применяется для гарантии отсутствия соответствующего антигена (ткань, заведомо не содержащая соответствующего антигена). В непрямом методе анализа используют сыворотку, которая не содержит антител к исследуемому объекту, например донорские сыворотки.

Обработку материала проводят, как для положительного контроля. Отрицательный контроль устанавливает неспецифическую флюоресценцию объекта вследствие неспецифического связывания иммуноглобулин. По отношению к этому контролю оценивают разведения исследуемых сывороток.

При высоких разведениях наблюдается такая же картина, как при контроле конъюгата.

Положительный контроль: в прямом методе используют препарат, оказавшийся положительным в ранее проведенных исследованиях. В непрямом методе в качестве положительного контроля используют заведомо положительную сыворотку. Контроль устанавливает реакционную способность ткани или конъюгата. В случае многоступенчатых реакций контролю должен подвергаться каждый этап.

Определение комплементсвязывающих антител:
Контроль комплемента:
ткани или клетки, заведомо не содержащие комплементсвязывающие антитела, инкубируют с комплементом или конъюгатом. Контроль показывает, содержит лн сыворотка с комплементом антитела к антигенам исследуемого препарата.

Для оценки специфичности антигена или антител можно воспользоваться адсорбцией сывороток определенным антигенами с последующим отделением иммунных комплексов.

Можно применять предварительную инкубацию препарата с антителами соответствующей специфичности, но принадлежащими другому биологическому виду (лучше всего к тому, от которого получена сыворотка для конъюгата); положительная реакция в этих случаях выражена слабее или вообще не наблюдается.

Титрование в шахматном порядке

Каждую новую серию конъюгата с целью определения оптимального разведения для непрямого метода проверяют титрованием в шахматном порядке с позитивными и негативными контрольными сыворотками. Схема перекрестной проверки представлена в таблице.

Пример титрования в шахматном порядке для определения оптимального рабочего разведения конъюгата

Обозначения:

Ø — отрицательная реакция, т. е.

отсутствие субъективного восприятия специфической флюоресценции;
X — интенсивная неспецифическая или нежелательная специфическая флюоресценция;± — слабая специфическая флюоресценция; субъективно ее можно спутать с отрицательным контролем;+ , + +, + + +  — специфическая флюоресценция от отчетливой до очень сильной.КП — конец плато, здесь при разведении конъюгата 1 : 80; ВСП — выход титра сыворотки на плато, здесь 1 : 320;

Рекомендуемое рабочее разведение конъюгата: 2—4-кратная концентрация конъюгата в КП; рекомендуется разведение 1:30.

Среды для заключения и хранения препаратов

Заключение препаратов в водосодержащие среды при рН 8,6 обеспечивает самую высокую степень флюоресценции и наименьшее «выцветание».

Препараты, высушенные и заключенные в неполярные среды, например иммерсионное масло (Piaflex химический комбинат Пистериц), энтеллан (Merck, Дармштадт), UV инертную (Serva, Гейдельберг), обладают только 50% интенсивностью флюоресценции и вдвое более сильным «выцветанием» по сравнению с препаратами, заключенными в водные среды. Среда для заключения расходуется экономно и по возможности без образования пузырей воздуха. Референс-препараты в высушенном виде хранятся при 4°С, в среде для заключения — при —20°С.

Источник: //www.ld.ru/reviews/ilist-4447.html

Реакция иммунофлюоресценции. Механизм, компоненты, применение

Иммунофлюоресценция

Иммунофлюоресцентный метод (РИФ, реакция иммунофлюоресценции, реакция Кунса) – метод выявления специфических АГ с помощью АТ, конъюгированных с флюорохромом. Обладает высокой чувствительностью и специфичностью.

Применяется для экспресс-диагностики инфекционных заболеваний (идентификация возбудителя в исследуемом материале), а также для определения АТ и поверхностных рецепторов и маркеров лейкоцитов (иммунофенотипирование) и др. клеток.

Обнаружение бактериальных и вирусных антигенов в инфекционных материалах, тканях животных и культурах клеток при помощи флюоресцирующих антител (сывороток) получило широкое применение в диагностической практике.

Приготовление флюоресцирующих сывороток основано на способности некоторых флюорохромов (например, изотиоцианата флюоресцеина) вступать в химическую связь с сывороточными белками, не нарушая их иммунологической специфичности.

Различают три разновидности метода: прямой, непрямой, с комплементом. Прямой метод РИФ основан на том, что антигены тканей или микробы, обработанные иммунными сыворотками с антителами, меченными флюорохромами, способны светиться в УФ-лучах люминесцентного микроскопа. Бактерии в мазке, обработанные такой люминесцирующей сывороткой, светятся по периферии клетки в виде каймы зеленого цвета.

Непрямой метод РИФ заключается в выявлении комплекса антиген – антитело с помощью антиглобулиновой (против антитела) сыворотки, меченной флюорохромом. Для этого мазки из взвеси микробов обрабатывают антителами антимикробной кроличьей диагностической сыворотки.

Затем антитела, не связавшиеся антигенами микробов, отмывают, а оставшиеся на микробах антитела выявляют, обрабатывая мазок антиглобулиновой (антикроличьей) сывороткой, меченной флюорохромами. В результате образуется комплекс микроб + антимикробные кроличьи антитела + антикроличьи антитела, меченные флюорохромом.

Этот комплекс наблюдают в люминесцентном микроскопе, как и при прямом методе.

Механизм. На предметном стекле готовят мазок из исследуемого материала, фиксируют на пламени и обрабатывают иммунной кроличьей сывороткой, содержащей антитела против антигенов возбудителя.

Для образования комплекса антиген — антитело препарат помещают во влажную камеру и инкубируют при 37 °С в течение 15 мин, после чего тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия для удаления не связавшихся с антигеном антител.

Затем на препарат наносят флюоресцирующую антиглобулиновую сыворотку против глобулинов кролика, выдерживают в течение 15 мин при 37 °С, а затем препарат тщательно промывают изотоническим раствором хлорида натрия.

В результате связывания флюоресцирующей антиглобулиновой сыворотки с фиксированными на антигене специфическими антителами образуются светящиеся комплексы антиген — антитело, которые обнаруживаются при люминесцентной микроскопии.

22. Иммуноферментный анализ — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения различных соединений, макромолекул, вирусов и пр., в основе которого лежит специфическая реакции антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала.

Классификация:

Конкурентный (в системе одновременно присутствует анализируемое соединение и его аналог)

Неконкурентный (Если в системе присутствуют только анализируемое соединение и соответствующие ему центры связывания (антиген и специфические антитела))

Прямой и непрямой

Прямой:

1.сыворотку,содержащую смесь ат, инкубируют с аг, фиксированным на твердом субстрате.

2.ат,не связывающие аг, удаляют многократным промыванием.

3. вносят меченную ферментом антисыворотку к ат, связывавшим аг

4.определят количество фермента-маркера, связавшегося с ат

Непрямой:

Ат-положительная сыворотка

1.специфические ат в иследуемой сыворотке связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. специфичные ат, меченные ферментом,не взаимодействуют со связанным аг-содержание маркера в субстрате низкое

Ат-отрицательная сыворотка

1. Неспецифические ат в исследуемой сыворотке не связывают аг, фиксированный на твердом субстрате

2. Специфические ат, меченные ферментом, взаимодействуют, с фиксированным аг –содержание маркера высокое

Наиболее распространен твердофазный ифа, при котором один из компонентов иммунной реакции(антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе. В качестве твердого носителя используется микропанели из полистирола.

При определении антител в лунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку крови, меченную ферментом, и смесь растворов для фермента и хромогена. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют не связавшиеся реагенты путем тщательного промывания.

При положительном результате изменяется цвет раствора хромогена.

Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не только антигеном, но и антителом. Тогда в лунки с сорбированными антителами вносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, меченную ферментом, а затем-смесь растворов субстрата для фермента и хромогена.

Применение:для диагностики заболеваний, вызванных вирусными и бактериальными возбудителями.

23. Серологическая реакция – реакция, с помощью которой исследуется реакция антигена (микроба, вируса, чужеродного белка) с антителами сыворотки крови.

Серологические исследования — это методы изучения определенных антител или антигенов в сыворотке крови больных, основанные на реакциях иммунитета. С их помощью также выявляют антигены микробов или тканей с целью их идентификации.

Обнаружение в сыворотке крови больного антител к возбудителю инфекции или соответствующего антигена позволяет установить причину заболевания.

Серологические исследования применяют также для определения антигенов групп крови, тканевых антигенов и уровня гуморального звена иммунитета.

Серологические исследования включают в себя различные серологические реакции:

1. Реакция агглютинации.

2. Реакция преципитации.

3. Реакция нейтрализации.

4. Реакция с участием комплемента.

5. Реакция с использованием меченых антител или антигенов.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

Источник: //studopedia.ru/17_65982_reaktsiya-immunoflyuorestsentsii-mehanizm-komponenti-primenenie.html

Adenovirus, иммунофлюоресценция

Иммунофлюоресценция

[10-034] Adenovirus, иммунофлюоресценция

1470 руб.

Выявление возбудителя аденовирусной инфекции (Adenovirus), в основе которого лежит обнаружение в биоматериале комплексов антигена аденовируса с меченными флюорохромом антителами.

Синонимы русские

Аденовирусная инфекция.

Синонимы английские

Adenovirus immunofluorescence.

Метод исследования

Иммунофлюоресценция.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Мазок урогенитальный, мазок из носоглотки, мазок с конъюнктивы.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Не принимать пищу в течение 2-3 часов до исследования, можно пить чистую негазированную воду.

Общая информация об исследовании

Аденовирусы – это ДНК-содержащие вирусы семейства Adenoviridae, из которых свыше 50 серотипов болезнетворны для человека, наиболее часто заболевания вызывают серотипы 1-8, 11, 35, 37, 40 и 41.

Аденовирусы широко распространены и встречаются как в виде единичных случаев, так и в виде эпидемических вспышек. Источник инфекции – больной человек или вирусоноситель, у которых вирусы выделяются до 3-7-го дня болезни с отделяемым верхних дыхательных путей и конъюнктивы и до 3 недель с фекалиями.

Путь передачи – воздушно-капельный или пищевой. Инкубационный период в среднем составляет 5-7 дней.

Аденовирусы вызывают развитие острых заболеваний, протекающих с преимущественным поражением органов дыхания, глаз и лимфатических узлов. Наиболее частыми клиническими формами аденовирусной инфекции являются ОРВИ, фарингит, фарингоконъюнктивальная лихорадка, тонзиллит, средний отит и эпидемический кератоконъюнктивит.

Возможно поражение органов желудочно-кишечного тракта с аденовирусным гастроэнтеритом (у детей гастроэнтерит обусловлен серотипами 40 и 41). Аденовирусная инфекция может быть причиной инфекционно-аллергических заболеваний, таких как астматический бронхит, ларинготрахеит и др.

Обычно болеют дети, особенно младшего возраста, у которых инфекция протекает тяжелее (с бронхиолитами, пневмониями и т. д.).

Аденовирусная инфекция нередко встречается у иммунокомпрометированных лиц (перенесших трансплантацию органов или костного мозга), поражая трансплантированные органы и системы (гепатит при трансплантации печени, геморрагический цистит или паренхиматозное поражение почек при трансплантации почек), однако при генерализации инфекции могут также страдть легкие, кишечник и центральная нервная система. Аденовирусная инфекция часто встречается при СПИДе и чаще всего затрагивает мочеполовой и желудочно-кишечный тракт.

Генерализация инфекции чаще наблюдается у детей и иммунокомпрометированных лиц и может привести даже к летальному исходу; как правило, она обусловлена 3-м, 7-м, 21-м и 30-м серотипами вируса.

В некоторых случаях аденовирус может быть причиной острого геморрагического цистита и других заболеваний мочеполовой системы, а серотипы 1, 6, 12 и особенно 7 способны вызывать спорадический энцефалит и менингоэнцефалит (в том числе как осложнения после ОРВИ).

У пациентов с гипогаммаглобулинемией может развиваться хронический менингоэнцефалит, обусловленный аденовирусами 7-го, 12-го и 32-го серотипов.

Для диагностики аденовирусной инфекции применяют методы культивирования вируса, определение его антигена или ДНК в тканях или крови, а также серологические методы (4-кратное увеличение титра антитела в парных сыворотках).

Наиболее быстрый и высокоспецифичный (до 90  %) способ диагностики аденовирусной инфекции – иммунофлюоресцентная микроскопия. Она основана на непосредственном связывании антигенов аденовируса в биоматериале с меченными флюорохромом антителами с образованием комплексов антиген-антитело и последующей их микроскопии в ультрафиолетовом свете.

Под воздействием ультрафиолета флюорохром начинает светиться, что позволяет быстро выявить антиген аденовируса.

Для чего используется исследование?

  • Для выяснения причин аденовирусной инфекции и ее мониторинга.
  • Для контроля за эффективностью лечения аденовирусной инфекции.
  • Для дифференциальной диагностики заболеваний, протекающих со сходными симптомами (наряду с другими тестами).

Когда назначается исследование?

  • При клинических симптомах аденовирусной инфекции, при конъюнктивите, геморрагическом цистите, фарингите.
  • При обследовании контактных лиц (по эпидемиологическим показаниям).

Что означают результаты?

Референсные значения: не обнаружено.

Причины положительного результата:

  • инфицирование аденовирусами.

Причины отрицательного результата:

  • отсутствие аденовирусной инфекции;
  • низкое содержание аденовирусов в исследуемом биоматериале.

Также рекомендуется

Кто назначает исследование?

Инфекционист, офтальмолог, пульмонолог, гастроэнтеролог, терапевт, педиатр.

Литература

  1. Кишкун А. А. Иммунологические и серологические исследования в клинической практике.  – М. : “Медицинское информационное агентство”, 2006. – 536 с.
  2. Baum S.G. Adenovirus. In: Principles and practice of infectious disease / G.L. Mandell, Bennett J.E., Dolin R (Eds) ; 6th ed. – Churchill Livingstone, Philadelphia, PA 2005. – 2701 p.
  3. Chernecky C.C. Laboratory tests and diagnostic procedures / C.C. Chernecky, B.J. Berger; 5th ed. – Saunder Elsevier, 2008. – 1232 pp.

Источник: //helix.ru/kb/item/10-034

Реакция иммунофлуоресценции (РИФ), или метод флуоресцирующих антител (МФА)

Иммунофлюоресценция

При данном методе используют явление люминесценции.

Сущность явления люминесценции заключается в том, что при поглощении различных видов энергии (световой, электрической и др.) молекулами некоторых веществ их атомы переходят в возбужденное состояние, а затем, возвращаясь в исходное состояние, выделяют поглощенную энергию в виде светового излучения.

В РИФ люминесценция проявляется в виде флуоресценции — это свечение, возникающее в момент облучения возбуждающим светом и прекращающееся сразу после его окончания.

Многие вещества и живые микроорганизмы обладают собственной флуоресценцией (так называемой первичной), однако интенсивность ее очень мала. Вещества, обладающие интенсивной первичной флуоресценцией и используемые для придания флуоресцирующих свойств нефлуоресцирующим веществам, получили название флуорохромы. Такая наведенная флуоресценция называется вторичной.

Для возбуждения флуоресценции при люминесцентной микроскопии чаще всего используют ультрафиолетовую или сине-фиолетовую часть спектра (длина волны 300—460 нм). Для этих целей в лабораториях имеются люминесцентные микроскопы различных моделей — МЛ-1—МЛ-4, «Люмам».

В вирусологической практике применяют два основных метода люминесцентной микроскопии: флуорохромирования и флуоресцирующих антител (или РИФ).

Флуорохромирование — это обработка препаратов флуорохромом с целью увеличения силы и контрастности свечения их.

Наибольший интерес представляет флуорохром акридиновый оранжевый, который вызывает полихроматическую флуоресценцию нуклеиновых кислот.

Так, при обработке препаратов этим флуорохромом дезоксирибонуклеиновая кислота ярко флуоресцирует зеленым цветом, а рибонуклеиновая — рубиново-красным.

Метод РИФ заключается в том, что антитела, соединенные с флуорохромом, сохраняют способность вступать в специфическую связь с гомологичным антигеном. Образующийся комплекс антиген + антитело в связи с присутствием в нем флуорохрома обнаруживают под люминесцентным микроскопом по характерному свечению.

Для получения антител используют высокоактивные гипериммунные сыворотки, из которых выделяют антитела и метят их флуорохромом. В качестве флуорохрома наиболее часто используют ФИТЦ-флуоресцеин изотиоционат (зеленое свечение) и РСХ-родамин сульфохлорид (красное свечение). Антитела, меченные флуорохромом, называют конъюгатом.

Методика приготовления и окрашивания препаратов заключается в следующем:

  • готовят на предметных стеклах мазки, отпечатки из органов или на покровных стеклах — инфицированную культуру клеток; можно использовать и гистосрезы;
  • препараты подсушивают на воздухе и фиксируют в охлажденном ацетоне при комнатной температуре или при минус 15 °С (от 15 мин до 4—16 ч);
  • окрашивают по прямому или непрямому методу; ведут учет под люминесцентным микроскопом по интенсивности свечения, оцениваемому в крестах.

Параллельно готовят и окрашивают препараты от здорового животного — контроль.

Различают два основных метода применения флуоресцирующих антител: прямой и непрямой.

Прямой метод (одноступенчатый). На фиксированный препарат наносят конъюгат (флуоресцирующую сыворотку к предполагаемому вирусу), выдерживают 30 мин при температуре 37 °С во влажной камере. Затем препарат отмывают от несвязанного конъюгата физиологическим раствором (pH 7,2 — 7,5), подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под микроскопом.

Прямой метод позволяет обнаружить и идентифицировать антиген. Для этого нужно иметь на каждый вирус флуоресцирующую сыворотку.

Непрямой метод (двухступенчатый). На фиксированный препарат наносят немеченую сыворотку, содержащую антитела к предполагаемому вирусу, выдерживают 30 мин при 37 °С, отмывают несвязанные антитела.

На препарат наносят флуоресцирующую антивидовую сыворотку, соответствующую виду животного — продуцента гомологичных противовирусных антител, выдерживают 30 мин при 37 °С.

Затем препарат отмывают от несвязанных меченых антител, подсушивают на воздухе, наносят нефлуоресцирующее масло и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Антивидовые сыворотки получают, иммунизируя глобулинами животных тех видов, которые служат продуцентами антивирусных антител. Так, если антивирусные антитела получали на кроликах, то используют флуоресцирующую антикроличью сыворотку.

Непрямой метод позволяет не только обнаружить и идентифицировать антиген, но и выявить и определить титр антител. Кроме того, этим методом можно обнаруживать одной меченой сывороткой антигены различных вирусов, так как он основан на использовании антивидовых сывороток. Чаще применяют антикроличьи, антибычьи, антилошадиные сыворотки и сыворотки против глобулинов морской свинки.

Разработаны несколько модификаций непрямого метода. Наибольшего внимания заслуживает метод с использованием комплемента.

Метод заключается в том, что на фиксированный препарат наносят инактивированную нефлуоресцирующую специфическую сыворотку и комплемент морской свинки, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, и для выявления комплекса антиген + антитело + комплемент наносят флуоресцирующую антикомплементарную сыворотку, выдерживают 30 мин при 37 °С, промывают, подсушивают на воздухе и исследуют под люминесцентным микроскопом.

Достоинства РИФ: высокая специфичность и чувствительность; простота техники постановки; требуется минимальное количество компонентов. Это экспресс-метод диагностики, так как в течение нескольких часов можно получить ответ.

К недостаткам можно отнести субъективизм в оценке интенсивности свечения и, к сожалению, иногда флуоресцирующие сыворотки бывают плохого качества. В настоящее время РИФ широко применяют в диагностике вирусных болезней животных.

, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Источник: //www.activestudy.info/reakciya-immunofluorescencii-rif-ili-metod-fluoresciruyushhix-antitel-mfa/

Ваш Недуг
Добавить комментарий