Гель-фильтрация

ПОИСК

    Диффузия в студнях лежит в основе гель-фильтрации — эффективного метода разделения молекул по их размеру. Этот метод позволяет отделять от макромолекул не только ионы солей, но и молекулы с низкой молекулярной массой.

С помощью гель-фильтрации можно отделить полисахариды от моносахаридов, белки от аминокислот и других низкомолекулярных соединений. [c.268]

    При гель-фильтрации раствор, содержащий разделяемые вещества, пропускают через колонку, заполненную зернами набухшего полимера.

Вещества, молекулы которых имеют большой размер и не могут проникать внутрь этих зерен, выходят из колонки вместе с растворителем. Меньшие по размеру молекулы других веществ диффундируют в набухшие зерна и задерживаются ими. Затем эти вещества вымывают из колонки чистым растворителем.

Выбор полимера для гель-фильтрации определяется размерами молекул и химическими свойствами разделяемых веществ, а также природой растворителя. [c.268]

    ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ, см. Эксклюзионная хроматография. [c.124]

    Принцип этого метода состоит в том, что анализируемые растворы медленно фильтруются через колонки, заполненные гелем. Поэтому метод называют также гель-фильтрацией. Частицы геля состоят из гибких линейных молекул высокомолекулярных вешеств (ВМВ), сшитых поперечными связями.

Сетчатая структура геля способствует его набуханию в воде. Набухший гель имеет пористую структуру с различным содержанием пор разного диаметра. Распределение пор по размерам или по микрообъемам является основной характеристикой геля. Она зависит от природы ВМВ, температуры и природы растворителя.

 [c.361]

    Гель-фильтрация (гель-проникающая хроматография) – способ разделения смеси веществ, различающихся размером молекул, основанный на их разной способности удерживаться в порах структурной сетки набухшего в данном растворителе сшитого полимера. [c.398]

    За последние годы широкое применение для разделения высокомолекулярных веществ и определения их молекулярной массы нашел предложенный Л. Поратом и П. Флодином метод гель-фильтрации (гель-хроматографии).

Гель-хроматография состоит в фильтровании исследуемого раствора через колонки, заполненные зернами набухающего трехмерного полимера (сефадекса).

Набухшие зерна сефадекса представляют собой своеобразные клетки , внутрь которых могут проникнуть путем диффузии только молекулы (ионы) подходящего размера. Более крупные молекулы проходят с фильтрационным потоком мимо зерен сефадекса (рис, 10.8).

Набор различных марок сефадексов с возрастающим размером клеток позволяет отделять низкомолекулярньк вещества от высокомолекулярных, разделять макромолекулы, изучать образование ассоциатов в макромолекулярныхрастворах. [c.299]

    При отсутствии взаимодействия с фазой геля Ко и КаУ изменяются от О до 1. Если константы превышают единицу, то на гель-фильтрацию накладываются другие процессы, в частности адсорбция и распределение в геле. Поэтому общее уравнение, описывающее процесс гель-хроматографии, имеет вид  [c.239]

    Процесс хроматографирования на мягких гелях принято называть гель-фильтрацией. [c.231]

    I.E. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ И ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ [c.381]

    Гели, молекулярные сита Гель-фильтрация, ситовая  [c.48]

    VI. ГЕЛЬ-ФИЛЬТРАЦИЯ И ГЕЛЬ-ПРОНИКАЮЩАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ [11 — 13]) [c.399]

    A. Ахунову и Д. H. Сахибову (1963, 1970) удалось получить гомогенную протекназу из яда гюрзы, причем, на последней стадии очистки (сефадекс Г-75 и ДЕАЕ-целлвдлоза) фермент обладал активностью, в 18 раз превышающий активность протеиназ цельного яда.

Молекулярный вес энзима при гель-фильтрации через сефадекс Г-100 35000—37000. Полученный фермент по своим свойствам близок к трипсину, причем подавление его активности ДФФ (5.10 Щ) указывает на важную роль серина в механизме действия энзима. [c.

87]

    Еще одна особенность хроматографии макромолекул связана с проблемой доступности всего объема неподвижной фазы внутри гранул.

Ограничение такой доступности вследствие статистического разброса размеров пор пространственной сеткн гранул используется для фракционирования макромолекул по размерам в методе гель-фильтрации, одиако в других вариантах хроматографии ограничение доступности не только уменьшает емкость системы, но и существенно затрудняет установление равновесия в неподвижной фазе. В этом плане обычные микропористые обменники на основе силикагеля, стекла п полистирола существенно уступают крупнопористым матрицам из целлюлозы и даже декстрана. К сожалению, матрицы двух последних типов легко деформируются и потому непригодны для хроматографии при повышенном давлении. Правда, в последние годы путем специальной обработки удалось получить крупнопористые, пригодные для фракционирования белков матрицы и из перечисленных выше жестких материалов их марки и характеристики приведены ниже. [c.47]

    См. о гель-фильтрации в табл. 206. [c.396]

    Жидкость неподвижной фазы, как и прп гель-фильтрации, может быть просто иммобилизована внутри пористых гранул, илп, например, быть прочно связана с волокнами набухшей целлюлозы, илп же покрывать тонкой пленкой гранулы из сплошного материала и поверхность пор внутри них.

Покрытие может осуществляться за счет смачивания, сорбции пли химическим путем. В последнем случае нередко пленка жидкости сводится к мономолекулярному слою вещества, способного удерживать близ своей поверхности молекулы колшонентов фракционируелюй смеси в соответствии со степенью их сродства к нему.

В этом случае о соотношении растворимостей говорить трудно, так что лучше оперировать только понятиями сродства того или иного компонента к неподвижной и подвижной фазам, что, впрочем, с позиций теории хроматографии сведется к точно такой же, как при истинном растворении, количественной характеристике равновесного распределения фракционируемого материала между двумя фазами. Если в процессе распределительной хроматографии участвуют две истинные жидкости, то для осуществления равновесного распределения вещества они сами тоже должны быть в равновесии между собой, т. е. в случае частичной их растворимости друг в друге должны быть взаилшо насыщенными. [c.8]

    Вязкоупругие свойства геля полимера и реализация начального градиента давления определяют его селективность при закачке в неоднородные по проницаемости пласты. Очевидно, что в пропластки с большей проницаемостью полимер внедрится на большую глубину, чем в малопроницаемые.

Кроме того, следует учесть, что при радиальной фильтрации градиент давления обратно пропорционален расстоянию от скважины.

Поэтому можно утверждать при внедрении раствора в высокопроницаемые зоны пласта на определенную глубину после процесса сшивки фильтрация в этом пропластке может быть существенно снижена, а при определенном заданном объеме закачки раствора и прочности образовавшегося геля фильтрация может быть вообще прекращена на длительное время.

В то же время в пропластках с пониженной проницаемостью, если даже в них и проникнет раствор, происходит движение жидкости после образования в них геля. Чем ближе к забою скважины, тем выше градиент давления и, следовательно, ниже сопротивления, которые оказывает гель течению воды, фильтрующейся вслед за ним остаточный фактор сопротивления подчиняется псевдопластическому характеру течения. [c.89]

    В соответствии с определением, данным в статье (11, а], ири гель-фильтрации используют водные растворы и гидрофильные гели, а ири гель-ироникающей хроматографии — органические растворителп и гидрофобные гели.

Фильтрование через гель применяется ири биохимических исследованиях и ири изучении природных соединений, гель-прони-кающая хроматография—для исследования синтетических высокомолекулярных соединений. Указанные методы включают также хроматографирование, или фильтрование , на молекулярных ситах [12].

Гель обычно характеризуют размерами молекул (точнее, интервалом молекулярных весов молекул), которые оп достаточно эффективно разделяет. [c.399]

    Если хроматографический процесс идет в наклонно расположен-ном, ровном и относительно толстом (несколько миллиметров), открытом с поверхности слое гранул, между которыми жидкость подвижной фазы течет только под действием силы тяжести, то его можно назвать хроматографией в толстом слое. Практически этот метод нашел себе применение только для гель-фильтрации. [c.13]

    Величина К в принципе может принимать любые положительные значения от О до оо. При ЙГ = О молекулы вещества не сорбируются и даже не входят внутрь гранул. Такая ситуация имеет место при гель-фильтрации крупных макромолекул.

При А оо вещество практически нацело сорбировано в неподвижной фазе. Значения вблизи К = характерны для гель-фильтрации малых молекул. Для хроматографического фракционирования при использовании сорбции любого рода, как правило, 1.

Именно такой случай [c.17]

    В этом процессе неподвижная фаза представляет собой твердый сорбент. Равновесие процессов сорбции и десорбции в условиях, достаточно далеких от насыщения емкости сорбента, устанавливается независимо для каждого компонента смеси веществ.

Различие в коэффициентах адсорбции обусловливает разницу в распределении этих компонентов между сорбентом и подвижной жидкой фазой. Соответственно чел1 большим сродством к сорбенту обладает данный компонент смеси, тем медленнее он будет мигрировать вслед за элюен-том вдоль колонки или пластинки.

Если сорбция происходит на наружной поверхности сплошных гранул, то имеет место адсорбционная хроматография в чистом виде.

Если же материал сорбента имеет пористую структуру и большая часть сорбирующей поверхности находится внутри его гранул, то в задержании молекул вещества в неподвижной фазе участвует еще и процесс их диффузии в неподвижной жидкости внутри пор, подобно тому как это имеет место при гель-фильтрации. Практически, впрочем, связывание вещества за счет сорбции доминирует. [c.9]

    Это явление первоначально было названо гель-фильтрацией , поскольку в качестве пространственной сетки использовали полимерные гели. Однако эти гели относительно легко деформируются и для хроматографии при высоком давлении непригодны, поэтому их стали заменять жесткими материалами, в частности пористым стеклом и силикагелем.

Иногда для этого варианта хроматографии вводят термин эксклюзивная хроматография ( ex lusion — исключение имеется в виду исключение из гранул крупных молекул). Поскольку сейчас силикагель явно вытесняет пористое стекло, мы сохраним для рассматриваемого варианта хроматографии прежнее название — гель-фильтрация. [c.

7]

    Пористые материалы для гель-фильтрации чаще всего выпускаются в виде сферических гранул целого набора диаметров с различными средними размерами нор. Выбор этнх размеров обоснован в гл. 4, посвящепной методу гель-фильтрации. [c.8]

    В некоторых специальных случаях вводят другие, похожие по смыслу коэффициенты.

Так, если вещество в неподвижной фазе находится целиком в растворе, как это имеет место при гель-фильтрации и распределительной хроматографии, то нередко пользуются величиной отношения концентраций (partition oeffi ient), которую тоже принято называть коэффициентом распределения Кц = J , где g и Сот — концентрации вещества в неподвижной и подвижной фазах соответственно. [c.17]

Физическая и коллоидная химия (1988) — [ c.268 ]

Руководство по газовой хроматографии (1969) — [ c.21 ]

Лабораторная техника органической химии (1966) — [ c.204 , c.206 ]

Аминокислоты Пептиды Белки (1985) — [ c.349 , c.361 , c.388 ]

Биологическая химия Изд.3 (1998) — [ c.97 ]

Аминокислоты, пептиды и белки (1976) — [ c.23 ]

Химия углеводов (1967) — [ c.0 ]

Нейрохимия Основы и принципы (1990) — [ c.86 ]

Биологическая химия (2002) — [ c.236 ]

Химия Краткий словарь (2002) — [ c.73 ]

Современная аналитическая химия (1977) — [ c.476 ]

Хроматография полимеров (1978) — [ c.81 ]

Жидкостная колоночная хроматография том 3 (1978) — [ c.82 ]

Энциклопедия полимеров Том 3 (1977) — [ c.0 ]

Энциклопедия полимеров том 1 (1972) — [ c.596 ]

Хроматографические материалы (1978) — [ c.28 ]

Руководство по газовой хроматографии (1969) — [ c.21 ]

Энциклопедия полимеров Том 1 (1974) — [ c.596 ]

Энциклопедия полимеров Том 3 (1977) — [ c.0 ]

Основы биохимии Т 1,2,3 (1985) — [ c.144 , c.145 ]

Курс органической химии (1979) — [ c.15 ]

Общая химия 1982 (1982) — [ c.319 ]

Общая химия 1986 (1986) — [ c.309 ]

Общая химия Издание 18 (1976) — [ c.317 ]

Общая химия Издание 22 (1982) — [ c.319 ]

Жидкостная хроматография при высоких давлениях (1980) — [ c.0 ]

Химия синтетических полимеров Издание 3 (1971) — [ c.62 ]

Химия биологически активных природных соединений (1970) — [ c.21 , c.199 ]

Ферменты Т.3 (1982) — [ c.54 , c.66 , c.67 , c.177 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) — [ c.212 ]

Методы общей бактериологии Т.3 (1984) — [ c.221 , c.233 ]

Руководство по газовой хроматографии (1969) — [ c.21 ]

Биофизическая химия Т.2 (1984) — [ c.294 ]

Переключение генов (1988) — [ c.96 ]

Методы очистки белков (1995) — [ c.197 , c.213 ]

Биосенсоры основы и приложения (1991) — [ c.467 ]

Методы практической биохимии (1978) — [ c.96 , c.97 ]

Структура и механизм действия ферментов (1980) — [ c.204 , c.205 ]

Молекулярная биология клетки Т.3 Изд.2 (1994) — [ c.212 ]

Биологическая химия (2004) — [ c.17 , c.45 , c.56 ]

Биохимия Т.3 Изд.2 (1985) — [ c.25 ]

Источник: //www.chem21.info/info/15433/

Большая Энциклопедия Нефти и Газа

Cтраница 1

Гель-фильтрация применяется главным образом для отделения макромолекул РѕС‚ низкомолекулярных солей, буферного обмена РІ растворах макромолекул, фракционирования макромолекул, особенно биополимеров РІ водных растворах, изучения ассоциации молекул ( измерение свободных Рё связанных небольших молекул РІ растворах макромолекул), определения констант равновесия РІ растворах макромолекул Рё полиэлектролитах.  [2]

Гель-фильтрация, для которой используют сшитые декстраны или полиакриламидные гели, основана РЅР° разделении углеводов РїРѕ размеру РёС… молекул; ее применяют для предварительного разделения полисахаридов РґРѕ начала определения РёС… строения. Р�онообменную хроматографию применяют для разделения углеводов СЃ ионизируемыми группами. Однако РІ боратном буфере можно разделить Рё нейтральные сахара; РІ этих условиях РѕРЅРё превращаются РІ боратные комплексы [39], которые затем фракционируют РЅР° ионообменной смоле РІ Р±Рѕ-ратной форме. Эти РІРёРґС‹ колоночной хроматографии часто используют совместно для определения степени чистоты Рё микрогетерогенности углеводсодержащего образца.  [3]

Гель-фильтрация все шире используется для фракционирования белков сыворотки. Наиболее подходящим в данном случае является сефадекс G-200.

С колонки этого геля белки сыворотки элюи-руются тремя пиками.

Первый РїРёРє соответствует РІ РѕСЃРЅРѕРІРЅРѕРј липо-протеидам Рё макроглобулинам, вторым РїРёРєРѕРј выходит IgG, РІ третьем РїРёРєРµ содержатся главным образом альбумин Рё трансферрин.  [4]

Гель-фильтрация применяется главным образом для отделения макромолекул РѕС‚ низкомолекулярных солей, буферного обмена РІ растворах макромолекул, фракционирования макромолекул, особенно биополимеров РІ водных растворах, изучения ассоциации молекул ( измерение свободных Рё связанных небольших молекул РІ растворах макромолекул), определения констант равновесия РІ растворах макромолекул Рё полиэлектролитах.  [5]

Гель-фильтрация является наиболее мягким способом фракционирования целлюлаз.

Метод наиболее эффективен для отделения целлобиаз, имеющих значительно более высокую молекулярную массу, чем эндоглюканазы Рё целлобиогидролазы, или низкомолекулярных эндоглюканаз СЃ молекулярной массой менее 20000 Да. Недостатком метода является многократное увеличение объема наносимых образцов РІ С…РѕРґРµ элюции, что требует последующего концентрирования, длительность процесса.  [6]

Гель-фильтрация относится Рє важнейшим методам, применяемым для очистки ферментов Рё РґСЂСѓРіРёС… белков. Чаще всего РѕРЅР° используется РЅР° завершающих этапах технологических схем выделения Рё очистки.  [7]

Гель-фильтрация является наиболее мягким способом фракционирования целлюлаз.

Метод наиболее эффективен для отделения целлобиаз, имеющих значительно более высокую молекулярную массу, чем эндоглюканазы Рё целлобиогидролазы, или низкомолекулярных эндоглюканаз СЃ молекулярной массой менее 20000 Да. Недостатком метода является многократное увеличение объема наносимых образцов РІ С…РѕРґРµ элюции, что требует последующего концентрирования, длительность процесса.  [8]

Гель-фильтрация позволяет разделять молекулы по их размеру.

Разделение этим методом осуществляется просто, занимает мало времени Рё может быть использовано как для аналитических, так Рё для препаративных целей. Метод особенно полезен для разделения веществ биологического происхождения.  [9]

Гель-фильтрация широко используется РІ медицинских лабораториях Рё для разделения компонентов биологических объектов.  [10]

Гель-фильтрация обладает рядом преимуществ по сравнению с диализом как метод очистки растворов от солей.

Метод позволяет легко отделять от макромолекул не только соли, но и другие молекулы с низкой молекулярной массой.

Например, РїСЂРё помощи гель-фильтрации можно отделять нуклеиновые кислоты РѕС‚ нуклеотидов Рё фенолов, полисахариды РѕС‚ сахаров, белки РѕС‚ аминокислот Рё РґСЂСѓРіРёС… РЅРёР·РєРѕРјРѕ лекулярных соединений.  [11]

Гель-фильтрация часто позволяет РїСЂРё условии тщательного проведения эксперимента количественно охарактеризовать состав [31] Рё устойчивость [32] таких комплексов.  [12]

Гель-фильтрация позволяет использовать это явление для определения содержания альбумина РІ сыворотке.  [13]

Гель-фильтрация подтвердила, что образующееся соединение имеет большую молекулярную массу, чем метас, РѕРєР·РёР» Рё продукты взаимодействия РёС… СЃ хроматами.  [14]

Гель-фильтрация на пластинках не требует какого-либо дорогостоящего оборудования.

Правда, в этом случае не пригодна и обычная аппаратура для тонкослойной хроматографии.

РџРѕ краям вдоль пластинки закреплены РґРІР° пластиковых стержня ( толщина 0 5 СЃРј), РЅР° которых фиксируется стеклянная покровная пластинка.  [15]

Страницы:      1    2    3    4

Источник: //www.ngpedia.ru/id639291p1.html

Разделение биологических молекул методом гель-фильтрации

Разделениемолекул по размерам и форме основанона свойствах молекулярногосита,которыми обладают многие пористыематериалы.

Наиболеечасто для этой цели применяют органическиеполимеры с трехмерной сетчатой структурой,придающей им свойства гелей. Разделениевеществ при помощи гелей, основанноена различиях в размере молекул, называетсягель-фильтрацией.

Гель-фильтрациюоткрыли в 1959 Д. Порат и П. Флодин, которыепоказали возможность фракционированияводорастворимых макромолекул,в т. ч.белков,по молекулярной массе, в качествеситаони использовали сшитый декстрановыйгель. В1964 Д. Мур предложил с помощью гель-проникающейхроматографииопределять молекулярную массуполимеров,фракционируя их на стирол-дивинилбензольномгеле.

Вкачестве молекулярного сита такжеприменяются пористые стеклянные гранулы,а сам метод разделения получил названиехроматографиифильтрованием через стекло с заданнымразмером пор.Понятие проникающаяхроматография включаетв себя все виды разделения молекул,основанные на принципе молекулярногосита.

Принцип,лежащий в основе метода проникающейхроматографии, прост. Хроматографическуюколонку заполняют набухшим гелем или

пористымистеклянными шариками и уравновешиваютс помощью соответствующего растворителя.Крупные молекулы, не проникающие в порысита, проходят между частицами геля, вто время как небольшие молекулы«застревают» в них и движутся с меньшейскоростью.

Длягель-фильтрации применяют гели на основедекстрана (сефадекс), полиакриламида(акрилекс, биогель Р), агарозы (сефароза,биогель А, сагавак), полиакрилоилморфина(энзокрилгель), полистиролов (Био-БидзS).

Гельобразует неподвижную фазу, в которой стоком буфера происходит разделениебиологических молекул. Гель формируютв колонках, чаще стеклянных, различногоразмера и диаметра (в зависимости отцели эксперимента).

Гель-хроматографияна сефадексе используется для обессоливаниярастворов белков (разделение крупныхбелковых молекул и малых молекул солей),определения молекулярных масс белков,разделения сложных смесей макромолекул.Размер биологических молекул являетсяглавным фактором их эффективногоразделения при движении в пористомгеле.

Гели, используемые для хроматографии,имеют разный размер пор, что позволяетделить вещества в широком диапазонемолекулярных масс ( 1000 — 1000000 дальтон).При прохождении через колонку гелясмеси молекул разного размера крупныемолекулы движутся быстрее, чем мелкие,так как последние за счет проникновенияв пористые гранулы геля проходят болеедлинный путь.

В конечном итоге компонентысмеси элюируются с колонки, наполненнойгранулами геля,в порядке уменьшения ихмолекулярной массы. Для характеристикипроцесса гель-фильтрации используютпонятия: свободный объем колонки (Vo)и объем элюции (Ve).

Свободный объем определяют путемпропускания через колонку раствора«голубогодекстрана»(высокомолекулярного вещества с массой2 х 106дальтон). Объем, с которым выходит пиковаяконцентрация голубого декстрана,называется свободным объемом колонки(Vo).Объем, с которым выходит пиковаяконцентрация разделяемого вещества,называется объемом элюции (Ve).

Вэтом простейшем варианте хроматографиимолекулы фракционируемых веществ недолжны обладать никаким специальнымсродством к неподвижной или подвижнойфазам. Неподвижнаяфазаздесь представлена жидкостью, находящейсявнутри пористых гранул,— точно такойже, как и жидкость подвижной фазы,проте­кающей между ними.

Благодарясилам сцепления с поверхностьюпространственной сетки полимера илииного пористого материала, образующегогранулы, жидкость внутри них остаетсянеподвижной и не увлекается течениемподвижной фазы. В подавляющем боль­шинствеслучаев применения гель-фильтрации длябиологических целей рабочей жидкостьюслужат водно-солевые растворы, аматериалы   гранул   гидрофильны.

Переход молекул вещества из подвижнойфазы в неподвижную и обратно за счетдиффузии ничем не затруднен. Инаяситуация складывается внутри гранул.Здесь диффузияболее или менее за­труднена из-застолкновений молекул диффундирующеговещества с нитями пространственнойсетки полимера или стенками пор.

Еслиразмеры молекул соизмеримы со среднимдиаметром каналов в гранулах, то этизатруднения становятся весьмасущественными и диффузия тормозится.

Можетсложиться и такое положение, когда частьвнутреннего объема гранул, т. е. частьобъема неподвиж­ной фазы (а иногда ивесь этот объем), оказывается недоступнойдля молекул вещества,  растворенного  в  подвижной фазе.

Различиестепени доступности объема неподвижнойфазы для молекул различных компонентовисходной смеси веществ является фактором,определяющим возможность ихфракционирования. Оче­видно, что онобудет происходить по размерам молекул(рис. 1).

Если в со­ставе смеси имеютсяочень крупные молекулы, вовсе непроникаю­щие внутрь гранул, то онибудут выходить из колонки или достигатькрая хроматографической пластины вместес передним фронтом подвиж­ной фазы(«фронтом элюции»). В то же время мелкиемолекулы, свободно диффундирующиевнутрь гранул, часть времени будутнаходиться в неподвижной фазе.

Статистически эта часть времени одинаковадля всех молекул такого размера и зависитот соотношения объемов жидкости внеподвижной и подвижной фазах. Такимобразом, все мелкие молекулы достигнутконца хроматографического пути болееили менее одновременно и заведомопозднее, чем крупные.

Молекулы промежуточныхразмеров, для которых из-за разбросазначений эффективных диаметров порвнутри гранул неподвижной фазы до­ступнатолько часть ее объема, должны, очевидно,перемещаться вдоль  колонки илипластины с промежуточной скоростью.

Рис.1. Гель-фильтрационнаяхроматография.Малые молекулы в об­разце могутпроникать внутрь гранул, вследствиеэтого они протекают через колонкумедленнее. Крупные молекулы, ко­торыене могут проникнуть в гранулы черезпоры, проходят сквозь колонку быстрее,чем более мелкие. Правильный раз­мерпор и свойства растворителя являютсярешающими для хорошего разделения.

Этоявление первоначально было названо«гель-фильтрацией», поскольку в качествепространственной сетки использовалиполи­мерные гели.

Однако эти гелиотносительно легко деформируются и дляхроматографии при высоком давлениинепригодны, поэтому их стали заменятьжесткими материалами, в частностипористым стеклом и силикагелем.

Иногдадля этого варианта хроматографии вводяттермин «эксклюзивная хроматография»(«exclusion» — исклю­чение; имеется в видуисключение из гранул крупных молекул).Поскольку сейчас силикагельявно вытесняет пористое стекло, мысохраним для рассматриваемого вариантахроматографии прежнее название —гель-фильтрация.

Очевидно,что размеры молекул связаны с их массами,но отнюдь не целиком ими определяются.

Это особенно важно учитывать в случаемакромолекул, размеры которых могутсущественно зави­сеть от плотностиупаковки полипептидной или полинуклеотиднойцепи.

В ограничении свободы диффузиичерез пространственную сетку пор внутригранул немалую роль может играть и формамоле­кулы. Очевидно, что сферическаяглобула будет диффундировать иначе,чем молекула такого же объема, новытянутая в виде палочки.

Какво всех хроматографических разделенияхизлишняя длина колонки приводит кразмыванию пика (Рис. 2).

Рис.2. Уширениеполос в колон­кеиз-за чрезмерной длины колон­ки.Так называемая эффективная частьколонки является достаточной дляразделения. Слишком длинные колонкине улучшают очистку, но вызываютразбавление образца из-зауширения полос.

Гель-фильтрационнаяхроматография является методомдля оценки молекулярной массы молекул.Гель-фильтрациятакже ока­зываетсяполезной для измерения равновесиймономер-мультимер при микромолярных(мкМ) концентрациях биомолекул (Рис. 3).

 Рис.3. Молекулы с известной молекулярноймассой дают возмож­ность оценитьмолекулярную массу неизвестной молекулы.В данном случае для исследуемой молекулынаблюдаются два пика, что указывает наравновесие мономер-димер.

Пористыематериалы для гель-фильтрации чащевсего выпускают­ся в виде сферическихгранул целого набора диаметров сразличными средними размерами пор.

Гелина основе декстрана (сефадексы)

Декстрантакже представляет собой полисахарид— в основном линейный полимер  на основе глюкозы, где звенья связаныβ-1,6-глюкозидной связью

Рис.2.Химическая форма декстрана.Это тоже  полиатомный   спирт с высокойстепенью гидрофильности, предоставляющийстоль же широкие, как и целлюлоза,возможности для модификации и такжехимически инертный. Устойчивость кдействию кислот у декстрана еще меньше,чем у целлюлозы.

Его не следует обрабатыватьболее крепким раствором, чем 0,1 н. НС1 (втечение 2 ч). К щелочи гели на основедекстрана более устойчивы: они сохраняютсвои свойства в 0,25 н. NaOH   до 2 месдаже при температуре 60оС. Рабочийдиапазон рН составляет 2-12.

Существенноеотличие от целлюлозы состоит в том, чтонити декстрина не образуют агрегатов,так как они не вполне линейны — имеютсядостаточно многочисленные ветвления(по связям 1.2-, 1,3- и 1,4-). Химическаяформа сефадекса.В гелях для хроматографии(«сефадексах») нити декстрана химически сшиты эпихлоргидрином.

Однако сшивкане очень жесткая: сефадексы относительномягки и легко сжимаются, а в водныхрастворах сильно набухают. Утери качествавыражены тем сильнее, чем меньшепроцентное содержание эпихлоргидрина.Изменяя долю сшивки, можно регулироватьсредний размер пор, образуемыхпространственной сеткой сшитого геля.

Ввиду статистического распределениясшивок по объему геля разброс размеровпор невелик, и сефадексы заметно болеегомогенны, а свойства их лучшевоспроизводимы, чем у целлюлозы.

Они«не боятся» высушивания и при замачиваниине требуют никакой специальной обработки.Сефадексы можно автоклавировать как всухом, так и во влажном виде в нейтральнойсреде при 120оСв течение 30 мин. Суспензию сефадекса(набитую колонку) следует хранить сантисептиком, так как он, подобноцеллюлозэ, легко атакуется микроорганизмами.

Сефадексам присуща некоторая адсорбционнаяспособность по отношению к ароматическими гетероциклическим молекулам, которуюдаже удается использовать дляфракционирования нуклеиновыхоснований,ароматических аминокислоти пептидов.

Кроме того, продажныесефадексы содержат в своей структуренебольшое количество карбоксильныхгрупп, что придает им некоторое сродствок катионам. При хроматографии его легкоподавить введением в элюент соли (NaCl)в концентрации около 0,02 М.

Мягкостьсефадексов (особенно слабосшитых)накладывает огра­ничения на допустимыезначения скоростей хроматографическонэлюцпи, которые подробно рассмотреныниже.

По этой же причине определенныесложности возникают при использованииионообмеиников па основе сефадексов:за счет сил электростатическогоотталкивания своих ионогенных группони склонны деформироваться при измененииионной силы элюента. Все это привело кразработке в последние годы ряда болеежестких матриц, вытесняющих сефадексыиз традиционных областей их применения— гель-фильтрации и ионообменнойхроматографии. 

Источник: //studfile.net/preview/4597154/

Гель-фильтрация, или метод молекулярных сит

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Для разделения белков часто используют хроматографические методы, основанные на распределении веществ между двумя фазами, одна из которых подвижная, а другая неподвижная. В основу хроматографических методов положены разные принципы: гель-фильтрации, ионного обмена, адсорбции, биологического сродства.

Метод разделения белков с помощью гель-фильтрационной хроматографии основан на том, что вещества, отличающиеся молекулярной массой, по-разному распределяются между неподвижной и подвижной фазами.

Хроматографическая колонка заполняется гранулами пористого вещества (сефадекс, агароза и др.). В структуре полисахарида образуются поперечные связи и формируются гранулы с “порами”, через которые легко проходят вода и низкомолекулярные вещества.

В зависимости от условий можно формировать гранулы с разной величиной “пор”.

Неподвижная фаза – жидкость внутри гранул, в которую способны проникать низкомолекулярные вещества и белки с небольшой молекулярной массой. Смесь белков, нанесённую на хроматографическую колонку, вымывают (элюируют), пропуская через колонку растворитель. Вместе с фронтом растворителя движутся и самые крупные молекулы.

Более мелкие молекулы диффундируют внутрь гранул сефадекса и на некоторое время попадают в неподвижную фазу, в результате чего их движение задерживается. Величина пор определяет размер молекул, способных проникать внутрь гранул (рис. 1-55).

Так как гелевая структура сефадекса легко деформируется под давлением, гели стали заменять более жёсткими матрицами (сефактил, той-оперл), представляющими сферические гранулы с разными размерами пор. Выбор размеров пор в гранулах зависит от целей хроматографии (о других хроматографических методах будет сказано ниже).

Ультрацентрифугирование

Метод разделения также основан на различии в молекулярных массах белков. Скорость седиментации веществ в процессе вращения в ультрацентрифуге, где центробежное ускорение достигает 100 000-500 000 g, пропорционально их молекулярной массе. На поверхность буферного раствора, помещённого в кювету, наносят тонкий слой смеси белков. Кювету помещают в ротор ультрацентрифуги.

При вращении ротора в течение 10-12 ч более крупные молекулы (с большей молекулярной массой) оседают в буферном растворе с большей скоростью. В результате в кювете происходит расслоение смеси белков на отдельные фракции с разной молекулярной массой (рис. 1-56).

После расслоения белковых фракций дно кюветы прокаливают иглой и по каплям собирают содержимое небольшими порциями в пробирки.

Очистка белков от низкомолекулярных
примесей

Для удаления низкомолекулярных соединений, в частности сульфата аммония после высаливания, применяют диализ.

Метод основан на том, что через полупроницаемую мембрану, пропускающую низкомолекулярные вещества, не проходят белки, имеющие более высокую молекулярную массу.

В стакан большой ёмкости (около 1 л) с буферным раствором помещают полупроницаемый мешочек, заполненный раствором белка с солью.

Скорость выхода соли из мешочка в буферный раствор пропорциональна градиенту его концентраций по обе стороны от мембраны. По мере выхода соли из мешочка буферный раствор в стакане меняют.

Для очистки белков от низкомолекулярных примесей используют также метод гель-фильтрации (см. выше).

Для определения частоты (гомогенности) выделенного белка применяют методы с высокой разрешающей способностью, например электрофорез в полиакриламидном геле, высокоэффективная хроматография высокого давления.

От чистоты лекарственного белкового препарата зависят его биологическая эффективность и аллергенность (т.е. способность вызывать аллергические реакции).

Чем качественнее очищен препарат, тем меньше вероятность осложнений при его применении.

Электрофорез белков

Метод электрофореза основан на различии в скорости движения белков в электрическом поле, которая определяется величиной заряда белка при определенных рН и ионной силе раствора.

, В последнее время широко применяется метод зонального электрофореза белков на различных носителях – на бумаге (целлюлозе), крахмале, в полиакриламидном геле.

Метод диск-электрофореза в полиакриламидном геле позволяет получить до 50 фракций белков, т.е. имеет очень высокую разрешающую способность

Метод основан на том, что при определённом значении рН и ионной силы раствора белки двигаются в электрическом поле со скоростью, пропорциональной их суммарному заряду. Белки, имеющие суммарный отрицательный заряд, двигаются к аноду (+), а положительно заряженные белки – к катоду (-).

Электрофорез проводят на различных носителях: бумаге, крахмальном геле, полиакриламидном геле и др. В отличие от электрофореза на бумаге, где скорость движения белков пропорциональна только их суммарному заряду, в полиакриламидном геле скорость движения белков пропорциональна их молекулярным массам.

Разрешающая способность электрофореза в полиакриламидном геле выше, чем на бумаге. Так, при электрофорезе белков сыворотки крови человека на бумаге обнаруживают только 5 главных фракций: альбумины, α1 глобулины, α2-глобулины, β-глобулины и γ-глобулины (рис. 1-57).

Электрофорез тех же белков в полиакриламидном геле позволяет получить до 18 различных фракций. Для обнаружения белковых фракций полоски бумаги или столбики геля обрабатывают красителем (чаще всего бромфеноловым синим или амидовым чёрным).

Окрашенный комплекс белков с красителем выявляет расположение различных фракций на носителе.

Электрофорез на бумаге.Электрофорез проводят с использованием боратных, фосфатных или веронал-мединаловых буферных растворов. Носителем служит специальная хроматографическая бумага, которую разрезают на полоски требуемого размера.

Наносят сыворотку крови на катодный конец смоченной буферным раствором полоски. В зависимости от типа прибора и условий опыта электрофорез на бумаге длится от 4 до 16 часов. Скорость движения белков пропорциональна величине их электрического заряда.

За определенное время белковые фракции пройдут различный путь и разделятся.

Электрофореграмма сыворотки крови на хроматографической бумаге:

Затем белки фиксируют высушиванием и красят красителями. Окрашенные зоны белковых фракций вырезают и элюируют специальным растворителем (растворNaOH) для фотометрического определения каждой фракции. При электрофорезе на бумаге белков сыворотки крови получается до 5 фракций: альбумины,a1-,a2-,b-,g-глобулины.

Электрофорез в гелях.В этом методе в качестве опорной среды используют крахмальный, агар-агаровый, полиакриламидный гели.

Характерной особенностью этой разновидности зонального электрофореза является его высокая разрешающая способность, поскольку гели функционируют как молекулярные сита: крупные молекулы проходят сквозь него тем медленнее, чем меньше размер пор в геле.

Методом электрофореза в агаровом геле в сыворотке крови выявляется до 7-8 фракций, а при электрофорезе в крахмальном или полиакриламидном геле – до 20 фракций. Агаровый гель ввиду большого количества воды в нем и вследствие этого большой скорости движения ионов используется в иммуноэлектрофорезе для обнаружения антигенов.

Самым перспективным является полиакриламидный гель, так как он прозрачен, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен, размер пор у этого геля можно варьировать в широких пределах и его можно использовать с самыми различными буферными растворами. Скорость движения белков пропорциональна их заряду и молекулярной массе.

Варианты электрофореза полиак. Геле

1. В вертикальных трубках

а – до фракционирования, б – после его окончания

2. На горизонтальной пластинке Схема прибора для электрофореза в горизонтальных пластинах

1-антиконденсационная крышка;

2 – электродный резервуар;

3 – колодец для внесения препарата;

4 – гель;

5 –фитиль;

6-охлаждающий столик

⇐ Предыдущая12345Следующая ⇒

Дата добавления: 2016-12-06; просмотров: 1781 | Нарушение авторских прав | Изречения для студентов

Источник: //lektsii.org/12-74241.html